CFDNA의 자동화된 모세관 전기영동 기반 단편 크기 분포 분석: 생체 유체에서 분리된 DNA 단편의 크기 분포를 연구하기 위한 DNA 마이크로칩 기반 방법

초록

출처: Palande, V. et al. 암 환자의 혈장 샘플에서 무세포 DNA 검출. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오에서는 자동화된 모세관 전기영동을 사용하여 cell-free DNA 또는 cfDNA 단편의 크기 분포를 분석합니다. 이 기술은 세포사멸 중에 암세포에서 방출되는 DNA 단편의 프로파일에 대한 통찰력을 얻는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. Fragment Analyzer에 의한 cfDNA의 DNA Fragment Size 분포

1. 절차를 시작하기 전 단계: DNA 염료 농축액과 DNA 겔 매트릭스를 30분 동안 실온에서 평형화합니다.
2. 젤 염료 믹스의 준비
   메모: DMSO는 유기 분자가 조직으로 쉽게 들어갈 수 있는 것으로 알려져 있으므로 용액을 주의해서 취급하십시오.
   1. DNA 염료 농축액 바이알을 10초 동안 와류로 처리하여 DMSO를 완전히 해동합니다.이 농축액 15μL를 DNA 젤 매트릭스 바이알에 피펫팅하여 어두운 곳에서 4°C에 보관합니다.
   2. 다시 말하지만, 겔과 염료의 혼합이 시각화될 때까지 뚜껑을 씌운 바이알을 10초 동안 소용돌이칩니다.
   3. 스핀 필터의 혼합물을 상단 소켓에 붓습니다.
   4. 스핀 필터를 실온에서 10분 동안 2,240 x g ± 20%로 마이크로 원심분리합니다.
   5. 튜브에 준비된 젤 염료에 라벨을 붙이고 좋은 실험실 관행에 따라 필터를 폐기합니다. 튜브에 라벨을 붙이고 준비 날짜를 기록합니다.
      메모: 좋은 실험실 관행에 따라 여과액을 폐기하십시오. 젤-염료 혼합물은 5개의 고감도(HS) DNA 칩에 사용할 수 있습니다. 1시간 이상 사용하지 않을 경우 4°C에서 보관하십시오. 어두운 곳에서의 보관은 최대 6주까지 가능합니다.
3. 젤 염료 혼합물을 로드하려면 칩 프라이밍 스테이션의 베이스 플레이트 위치를 확인하고 가장 낮은 위치에서 클립을 조정하십시오.
   1. 겔-염료 혼합물을 30분 동안 실온으로 평형을 이루면서 빛 노출을 모니터링합니다.
   2. 밀봉된 백에서 새 HS DNA 칩을 꺼내 칩 프라이밍 스테이션에 놓은 다음 겔-염료 혼합물 9.0μL를 제거하고 'G'.
      로 표시된 칩 웰 바닥에 분배합니다. 메모: 바이알 바닥에 쌓일 수 있는 입자를 피하면서 젤-염료 혼합물을 추출합니다. 겔-염료 혼합물을 HS DNA 칩에 잘 분배하면서 피펫 끝을 완전히 삽입하여 큰 기포가 형성되지 않도록 합니다. 또한 우물 가장자리에서 피펫을 만지면 결과가 좋지 않습니다.
   3. 플런저를 1mL에 놓고 칩 프라이밍 스테이션을 닫습니다. 래치의 잠금이 딸깍 소리를 내며 작동하는지 확인하고 타이머를 60초로 설정한 다음 클립이 잡힐 때까지 플런저를 누르고 정확히 60초 후에 클립 해제 장치로 플런저를 해제합니다.
   4. 플런저가 최소 0.3mL 표시까지 후퇴하면 5초 동안 기다린 다음 천천히 1mL 위치로 다시 당긴 다음 칩 프라이밍 스테이션을 열고 다시 9.0μL의 겔-염료 혼합물을 제거하고 'G'로 표시된 HS DNA 웰 하단에서 분주합니다.
4. DNA 마커를 로드하려면 DNA 마커 5μL를 래더 기호가 표시된 웰에 분배합니다. 11개의 샘플 웰 모두에 대해 절차를 반복합니다.
5. ladder와 샘플을 로드하려면 ladder 기호가 표시된 웰에 DNA ladder 1μL를 분배한 다음 11개의 샘플 웰 모두에 1μL의 샘플(사용된 웰) 또는 1μL의 마커(사용하지 않은 웰)를 추가합니다.
6. 칩을 어댑터에 수평으로 배치하여 60rpm에서 2,400초 동안 HS DNA 칩을 소용돌이칩니다. HS DNA 칩을 고정하는 돌출부가 와류 중에 손상되지 않았는지 확인하십시오.
7. 단편 분석기 기기에 HS DNA 칩을 삽입하려면 뚜껑을 열고 전극 카트리지가 제대로 삽입되었는지, 칩 선택기가 단편 분석기 기기에서 'dsHigh Sensitivity DNA'에 위치했는지 확인하십시오.
8. HS DNA 칩을 한 방향으로만 맞는 소켓에 조심스럽게 장착한 다음 전극 카트리지가 HS DNA 칩의 웰에 정확히 맞는지 확인하여 덮개를 닫습니다.
9. 단편 분석기 소프트웨어 화면의 디스플레이는 삽입된 HS DNA 칩과 닫힌 뚜껑을 화면 왼쪽 상단의 칩 아이콘을 통해 나타냅니다.
10. HS DNA 칩 실행을 시작하려면 기기 화면의 'Assay' 메뉴에서 dsDNA High Sensitivity Assay를 선택한 다음 샘플 이름 및 주석과 같은 정보를 입력하여 샘플 이름 테이블을 올바르게 채우고 화면 오른쪽 상단의 'Start' 버튼을 클릭하여 칩 실행을 시작합니다.
11. HS DNA 칩 실행 후 전극 세척: 분석이 완료되는 즉시 사용한 HS DNA 칩을 제거하고 우수한 실험실 관행에 따라 폐기하십시오. 다음 절차를 수행하여 전극이 이전 분석에서 잔여물 없이 깨끗한지 확인합니다.
    1. 전극 세정제 웰 중 하나에 350μL의 탈이온화 분석 등급 물을 천천히 채우고 뚜껑을 열어 전극 세척제를 단편 분석기 기기에 넣은 다음 뚜껑을 닫고 약 10초 동안 기다립니다.
    2. 뚜껑을 열어 전극 클리너를 제거하고 뚜껑을 닫기 전에 전극의 물이 증발할 때까지 10초 더 기다립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2100 바이오분석기 기기	애질런트 테크놀로지스, Inc.	G2939BA	2100 Bioanalyzer 시스템은 생체 분자의 시료 품질 관리를 위한 확립된 자동 전기영동 도구입니다.
프라이밍 스테이션을 위한 조정 가능한 클립	애질런트 테크놀로지스, Inc.	5042-1398	칩 프라이밍을 위해 정의된 압력을 적용하기 위해 주사기와 함께 사용됩니다.
cf-DNA/cf-RNA 방부제 튜브	노르겐 바이오텍	63950	Norgen의 cf-DNA/cf-RNA 방부제 튜브는 보관 및 배송 중 인간 전혈 샘플에서 cf-DNA, 순환 종양 DNA, cf-RNA 및 순환 종양 세포의 수집 및 보존을 위한 밀폐형 진공 플라스틱 튜브입니다
칩 프라이밍 스테이션	애질런트 테크놀로지스, Inc.	5065-4401	각 분석 키트와 함께 제공되는 주사기를 사용하여 겔 매트릭스를 칩에 로드하는 데 사용되며 RNA, DNA 및 단백질 분석에 사용됩니다. 프라이밍 스테이션, 스톱워치, 주사기 클립 1개 포함
전극 클리너 키트	애질런트 테크놀로지스, Inc.	5065-9951	교차 오염을 방지합니다. 전극에서 박테리아 또는 단백질 오염 물질을 제거합니다.
젤 매트릭스용 필터	애질런트 테크놀로지스, Inc.	제185-5990	DNA 염료 농축액과 DNA 젤 매트릭스의 적절한 혼합에 사용
IKA 기본 칩 볼텍스	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Bioanalyzer 분석 칩에서 DNA ladder와 DNA 샘플의 적절한 혼합에 사용됩니다.
50ml 원심분리기 튜브
에탄올 (96–100%)
56°C에서 가열 블록 또는 이와 유사한 것(2ml 수집 튜브를 수용할 수 있음)
인산염 완충 식염수(PBS)
피펫(조절 가능)
멸균 피펫 팁(교차 오염을 방지하기 위해 에어로졸 장벽이 있는 피펫 팁이 권장됨)
60°C에서 50mL 원심분리기 튜브를 고정할 수 있는 수조 또는 가열 블록

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