액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

초록

출처: Bonner, E. R. et al. 환자 생체액에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR)으로 표적 핵산을 검출하기 위해 유화된 나노 액적을 생성하는 단계별 절차를 제시합니다.

프로토콜

>1. dPCR을 이용한 표적 DNA의 검출 및 정량화

1. 220 μL의 유전형 분석 마스터 믹스, 10 μM 와일드형 및 돌연변이 프로브 각각 8.8 μL, 10 μM 정방향 및 역방향 프라이머 각각 39.6 μL, 액적 안정화 오일 17.6 μL를 첨가하여 PCR 스트립 튜브의 8웰에 대한 dPCR 반응 혼합물을 준비합니다.
2. 전체 부피를 10-20회 위아래로 피펫팅하여 dPCR 반응 혼합물을 부드럽게 혼합합니다. 반응 혼합물에 액적 안정화 오일을 첨가한 후 와류나 원심분리를 하지 마십시오.
3. PCR 8-well strip tube를 얻고 38μL의 dPCR 반응 혼합물을 각 well의 바닥에 직접 분주합니다. 깨끗한 피펫 팁으로 기포를 제거합니다.
   참고: 서로 맞물리거나 단단히 포장된 PCR 스트립 튜브는 정전기를 일으켜 dPCR 데이터를 분석할 때 유착 및 잡음 신호를 유발할 수 있습니다. 이를 방지하려면 부분 표본 스트립을 별도의 생물학적 위험 백에 넣고, 백을 과도하게 포장하지 않으며, 튜브가 서로 마찰되지 않도록 하십시오.
4. 12 μL의 사전 증폭된 DNA 샘플을 PCR 스트립 튜브의 적절한 웰에 추가합니다. 음성 대조군의 경우 12μL의 MB H₂O.
   를 추가합니다. 참고: 복제 웰에서 cfDNA 샘플을 분석합니다. CSF의 경우 최소한 중복 분석하고, 혈장/혈청의 경우 각 시료를 3회 분석합니다.
5. 전체 부피를 위아래로 10회 부드럽게 피펫팅하여 반응 혼합물을 DNA 샘플과 혼합합니다.
6. 새로운 액적 생성 기기 칩을 얻고 PCR 스트립 튜브의 웰 1–8에서 칩의 해당 채널 A–H로 전체 부피를 피펫팅합니다. 피펫 팁으로 채널 바닥을 만지지 마십시오.
7. 깨끗한 새 PCR 스트립 튜브를 구하여 액적 발생 기기에 삽입합니다. 액적 생성 기기 칩 ID를 스캔하거나 기기 컴퓨터의 소프트웨어에 수동으로 입력합니다. 8개 채널 각각에 대한 이름을 입력합니다. Start the run을 클릭하여 샘플 방울화를 시작합니다.
8. 액적 주입이 완료되면 PCR 스트립 튜브를 제거하고 스트립 튜브 캡을 적용합니다.
9. 스트립 튜브를 열 순환기로 옮기고 웰당 80μL의 물을 포함하는 다른 스트립 튜브와 균형을 맞춥니다.
10. 열 순환 조건을 다음과 같이 프로그래밍합니다: 95°C에서 10분, 두 온도에서 45회 주기: 95°C에서 30초 동안 어닐링 온도, 98°C에서 10분, 10°C에서 유지.
    1. 램프 속도를 0.5°C/s로 설정하고 샘플 부피를 80μL로 설정합니다.
11. 열 사이클링이 완료되면 스트립 튜브를 제거하고 정량화 기기로 옮깁니다. PCR 스트립 캡을 제거하고 고속 캡으로 교체하십시오.
12. 정량화 기기와 기기 소프트웨어가 있는 연결된 컴퓨터를 켭니다. 기기 소프트웨어를 실행하고 실행 설정을 클릭합니다.
13. 스트립 튜브를 정량화 기기에 놓습니다.
14. 새로운 정량화 기기 칩을 구하고 칩 ID를 스캔하거나 기기에 수동으로 입력합니다. 칩을 기계에 삽입합니다.
15. 칩 위에 금속 실드를 놓고 기기의 뚜껑을 닫습니다.
16. 컴퓨터 소프트웨어에서 dPCR 실행의 이름과 8개 채널(A–H) 각각에 대한 이름을 입력합니다. 고속 모드(고속 캡과 함께 사용해야 함)를 선택하고 시작을 클릭하여 수량화를 시작합니다.
17. 정량 분석이 완료되면 금속 실드(저장 및 재사용 용)를 제거하고 PCR 스트립 튜브 및 칩을 폐기합니다. 기기 컴퓨터에서 실행 로그에는 각 실행에 대한 결과 파일이 포함됩니다. 각 샘플에 대한 .fcs 파일을 사용하여 분석가 소프트웨어로 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Raindance 소모품 키트	바이오 라드	제20-04411	액적 생성 기기 칩, 정량화 기기 칩, 고속 캡을 포함한 PCR 스트립 캡 및 액적 안정화 오일이 포함되어
Raindance Sense 악기	바이오 라드		정량화 기기
Raindance 소스 악기	바이오 라드		액적 발생 기기
RainDrop Analyst II 소프트웨어	RainDance 기술		데이터 분석에 사용되는 애널리스트 소프트웨어
써모믹서 C	에펜도르프	14 285 562오후
미니앰프 써멀 사이클러	써모피셔 사이언티픽	A37834
PCR 8웰 스트립 튜브 캡	폭스바겐	제10011-786
PCR 8웰 스트립 튜브	액시겐	PCR-0208-C
Q5 핫 스타트 하이파이 2x 마스터 믹스	뉴잉글랜드 Biolabs Inc	M0494S