MSC Seeded Scaffold Preparation: 쥐 모델에 외과적 이식을 위해 중간엽 줄기세포로 파종된 골격을 준비하는 기술

초록

출처: Sheets, K. T. et al. 이미지 유도 교모세포종 절제 및 치료 줄기세포 종자 골격의 두개내 이식.J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 중간엽 줄기세포(MSC)를 생분해성 폴리(젖산)(PLA) 골격에 파종하는 기술을 설명합니다. 준비된 골격은 뇌의 외과적 절제강에 이식될 수 있으며, 여기에서 종양 병소를 향해 이동할 수 있습니다. 또한, 이러한 세포는 암세포의 세포사멸을 자극하기 위해 치료 단백질을 발현하도록 조작될 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 골격 준비

참고: 골격은 마우스에 이식하기 48시간 전에 준비해야 합니다. 다음 볼륨은 스캐폴드 단위로 제공됩니다. 추가 스캐폴드를 위해 필요에 따라 수량을 곱합니다.

1. 폴리(젖산)(PLA) 골격을 절제 캐비티 크기(약 2mm x 2mm) 조각으로 자릅니다. 스캐폴드는 가위를 사용하여 손으로 절단하거나 반복성을 위해 구멍 펀치를 사용하여 절단할 수 있습니다.
2. 70% 에탄올에 15분 동안 담근 후 PBS에 담가 살균합니다. 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에 골격을 배치하면서 파종을 위해 세포를 준비합니다.
3. 0.05% 트립신(T75 플라스크의 경우 3–5mL)을 사용하여 배양된 MSC를 들어 올립니다. 37 ° C에서 5 분 동안 배양하십시오. 세포가 들어올랐는지 확인한 다음 플라스크에 7–10mL DMEM을 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
4. 플라스크 내용물을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 펠렛: 5 x 10, 5 MSCs, 100 x g에서 5분 동안 원심분리를 통해 각 스캐폴드에 대해.
5. 상층액을 흡입하고 5 x 10⁵ 세포당 5μL DMEM에서 MSC를 재현탁합니다.
6. 파종을 위해 발판을 두드려 건조시켜 준비합니다.
   1. 겸자로 DMEM 침지에서 골격을 제거하고 6웰 플레이트의 뚜껑에 임시로 놓습니다. 뚜껑에서 골격을 들어 올려 과도한 DMEM 방울을 남깁니다.
   2. 비계를 새롭고 건조한 위치에 다시 뚜껑에 놓습니다. 3-5회 반복한 다음 부분적으로 건조된 골격을 새 6웰 플레이트에 넣어 파종합니다. 각 scaffold.
      에 대해 반복합니다. 메모: 부분적으로 건조된 스캐폴드는 최적의 세포 파스팅 결과를 제공합니다. 스캐폴드가 너무 젖으면 세포가 스캐폴드에서 미끄러져 아래의 웰 플레이트에 달라붙습니다. 골격이 너무 건조하면 액적이 전체 골격에 퍼지지 않아 초기 세포 분포가 불량해집니다.
7. 피펫을 사용하여 줄기 세포의 바이알을 부드럽게 혼합하여 일부 세포가 바닥에 가라앉았을 수 있으므로 현탁액을 균질화합니다.
8. MSC 현탁액을 2.5μL 신선하게 혼합한 것을 골격에 직접 천천히 피펫팅하여 골격 상단에 작은 물방울을 만듭니다.
9. 각 웰의 가장자리에 300μL DMEM을 추가합니다. 이렇게 하면 세포 방울의 급격한 증발을 방지할 수 있습니다. 37°C에서 30분 동안 배양하여 세포가 골격에 부착되도록 합니다.
10. 집게를 사용하여 웰 플레이트에서 비계를 부드럽게 뒤집습니다. 2.5μL 신선하게 혼합된 MSC 현탁액을 시드합니다(그 결과 골격당 총 5 x 10⁵개의 세포가 시딩됨). 37°C에서 30분 동안 배양하여 세포가 골격에 부착되도록 합니다.
11. 6-well 플레이트의 각 well에 2mL를 추가하여 DMEM의 스캐폴드를 덮습니다. 미디어가 그 아래로 흐르도록 스캐폴드를 부드럽게 들어 올립니다. 이식 수술 전에 이 상태에서 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
12. 24시간 후에 스캐폴드를 확인하고 pH 불균형으로 인해 과도한 증발 또는 변색된 매체가 관찰되는 경우 매체를 추가/교체합니다.