신경교종 세포의 형광 라벨링: 심부 조직 이미징을 위해 형광 단백질을 발현하는 신경교종 세포를 얻기 위한 렌티바이러스 벡터 기반 형질주입 방법

초록

출처: Benitez, J. A. et al. 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 형광 분자 단층 촬영. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 적외선 형광 단백질 또는 iRFP를 발현하기 위해 신경교종 세포를 유전적으로 조작하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 형광 태그가 지정된 신경교종 세포는 뇌종양의 발달을 이해하기 위한 심층 조직 이미징에 유용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. FP635 또는 FP720 구조체를 사용한 교모세포종 세포의 라벨링

1. 아래 설명된 프로토콜에 따라 렌티바이러스를 생산하고 정제합니다.
   1. 1일차에 씨를 뿌린 요리를 관찰하십시오. 세포가 80–90% 융합되면 transfection을 할 준비가 된 것입니다.
      참고: 세포는 여전히 1-2개의 세포 분열을 거칠 수 있는 공간이 있어야 합니다
   2. 4개의 플라스미드를 50mL 튜브에 분주하여 플라스미드 혼합물을 준비합니다. 12 × 15cm 조리 요법의 경우 전달 벡터 270μg, pMDL(Gag/Pol) 176μg, pVSVG(수포성 구내염 바이러스 당단백질) 95μg 및 pREV 68μg을 사용합니다.
   3. 0.25M CaCl₂ (여과 된 ddH₂O로 희석) 13.5mL를 준비하고 플라스미드 혼합물에 첨가한다. 13.5mL 2× BBS 용액을 추가합니다. 여러 번 뒤집어서 부드럽게 혼합하고 실온(22–26°)에서 15분 동안 배양합니다.
   4. 트랜스펙션 혼합물(방울 단위로 퍼짐)을 각 플레이트(플레이트당 2.25mL)에 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 휘젓고 3% CO₂, 37 °C에서 하룻밤(16-20시간) 동안 배양합니다.
   5. 세포를 관찰하십시오. 그들은 합류점에 도달해야 합니다. 렌티벡터 플라스미드에 가시적 마커(예: GFP)가 존재하는 경우, transfection 효율을 육안으로 평가할 수 있습니다. 이상적으로는 transfection 효율이 >90%여야 합니다.
   6. 미디어를 제거하고 각 접시에 15mL의 신선한 DMEM + 2% FBS를 추가하고 10% CO₂, 37 °C로 옮깁니다.밤새 배양합니다.
   7. 상층액의 첫 번째 수확물 수집: 접시에서 상등액(12개 요리 × 15ml/접시 = 180mL)을 수집하고 풀링합니다.
   8. 각 접시에 신선한 DMEM 15mL + 2% FBS를 추가합니다. 10% CO₂, 37 °C에서 밤새 접시를 배양합니다. 렌티바이러스 상등액이 들어 있는 용기는 2차 격납용기(밀봉된 비닐 봉지)에 넣고 4°C에서 보관해야 합니다.
   9. 바이러스 제제 농축: 초원심분리로 바이러스 입자를 농축합니다. 20°C에서 2시간 동안 70,000 x g에서 상층액을 원심분리합니다. 원뿔형 튜브(둥근 바닥 튜브와 반대)와 스윙 버킷 로터(고정 각도 로터와 반대)가 권장됩니다(이 조합으로 인해 거의 보이지 않는 펠릿을 더 쉽게 찾을 수 있기 때문). 당사는 Beckman SW28 로터(튜브 6개 용량)가 있는 원뿔형 튜브를 19,400rpm에서 20°C에서 2시간 동안 사용합니다. 튜브에 30mL의 상등액을 채웁니다. 12 × 15cm 접시 준비에서 상등액의 총 부피는 360mL입니다. 따라서 전체 볼륨을 처리하려면 두 번의 연속 스핀이 필요합니다. 튜브를 로드하고, 첫 번째 스핀을 수행하고, 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 붓고, 새로운 바이러스 상등액을 다시 로드하고 두 번째 스핀을 수행합니다.
   10. 상층액을 붓고 거꾸로 된 튜브를 종이 타월에 올려 나머지 액체를 배출합니다. 펠릿에서 모든 액체를 제거하기 위해 흡입기를 사용하여 남아 있는 물방울을 빨아들입니다. 펠릿은 작은 반투명 점으로 거의 보이지 않아야 합니다.
   11. 바이러스 펠릿을 100μL의 1× HBSS에 재현탁합니다. 거품을 피하십시오. 100μL의 1× HBSS로 튜브를 헹굽니다. 두 부피를 모두 풀링하여 200μL 최종 부피를 얻습니다.
   12. 스크류 캡 마이크로퓨지 튜브로 옮기고 파라필름으로 감싸고 15-30분 동안 저속으로 와류를 일으킵니다. 재현 유 된 바이러스 제제는 맑은 것부터 약간 유백색까지 어디에서나 보입니다.
   13. 탁상용 마이크로 원심분리기에서 10초 동안 회전하여 서스펜션을 청소합니다. 상층액을 새 스크류 캡 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 상층액의 20μL 분취량을 만듭니다. 이 바이러스 상등액은 체외 등급의 품질입니다.
2. 15cm 접시에 DMEM과 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 인간 신경교종 세포주에서 약 2.0 x 10⁶ 세포를 배양하거나, T75 플라스크에서 DMEM/F12 1:1 배지와 B27 보충제를 함께 사용하여 인간 교모세포종 환자 유래(GBM-PDX) 구체 2.0 x 10 6개를 배양합니다.
3. 모든 셀을 37°C, 5% CO₂ 및 100% 상대 습도로 유지합니다.
4. 세포를 분리하십시오.
   1. 신경교종 세포의 경우: 플레이트에서 상등액을 제거하고 신경교종 세포에 3-5mL의 트립신 1X를 첨가합니다.
   2. GBM 구의 경우: 세포를 15mL 튜브에 피펫팅하여 세포를 수집합니다.
      1. 실온에서 탁상용 원심분리기를 사용하여 200 x g에서 5분 동안 GBM 구를 스핀다운합니다.
      2. 상층액을 제거하고 3-5mL의 세포 분리 용액을 추가합니다.
   3. 모든 세포를 37°C에서 10-15분 동안 배양합니다.
5. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 세포를 조심스럽게 해리하고(구체와 신경교종 세포가 완전히 분리되었는지 확인) 200 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다.
6. 상층액을 제거하고 위아래로 여러 차례 피펫팅하여 5mL의 배지로 세포를 재현탁합니다. 트리판 블루 제외를 통해 세포 생존율을 결정합니다.
7. 1.0 x 10⁶개의 타겟 세포를 10cm 접시에 5mL의 배지와 함께 피펫팅하여 플레이트화합니다.
8. multiplicity of infection (MOI) 5에서 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스로 세포를 형질주입하고 37 °C에서 배양합니다.
9. 24시간 후, 형질도입된 세포에서 배지를 제거하고 새로운 배지 5mL를 첨가한 후 37°C에서 추가로 48시간 동안 배양합니다.
10. 위에서 설명한 대로 트립신을 사용하여 감염된 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 200 x g에서 5분 동안 세포를 스핀다운하고 500μL의 분류 용액(1% FBS를 함유한 인산염 완충 식염수(PBS))에 재현탁합니다.
11. 세포 현탁액을 FACS 튜브에 피펫팅합니다. 죽은 세포를 배제하기 위해 1μL/mL의 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 디하이드로클로라이드로 세포를 공동 염색합니다. 유세포 분석기 게이트(비형질도입 세포 및 비형질 주입 세포/DAPI 염색)를 설정하려면 음성 대조군이 필요합니다.
12. 형광 양성/DAPI 음성 세포를 분류 용액으로 분류하고 분류된 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 모읍니다.
13. 분류된 세포를 200 x g에서 5분 동안 스핀다운하고 상층액을 제거한 다음 5mL의 배양 배지에 재현탁합니다. 피펫팅으로 분류된 세포를 10cm 접시에 파종합니다. 37 ° C에서 최소 48-72 시간 동안 배양하십시오.
14. 상기한 바와 같이 세포를 해리하고 in vivo 실험을 위해 여러 접시로 플레이팅하여 분류된 세포를 확장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/고혈당	하이클론/GE	SH30022.1
DMEM/F12 1:1	지브코	제11320-082
FBS(증권 시세	하이클론/GE	SH30071.03
아카쿠타아제	혁신적인 셀 기술	AT-104
트립신	하이클론/GE	SH30236.01
B27 보충제	지브코	17504044
인간 재조합 EGF	스템셀 기술	2633
인간 재조합 FGF	스템셀 기술	2634
디피에스	코 닝	번호: 21-031-00
FACS 튜브	송골매	352235
다피	써모피셔 사이언티픽	62248
p24 엘리사	클론텍	632200
세포 분류기	소니	SH8007 (영어
초원심분리기 Optima L-80 XP	벡크만 쿨터	392049
조직 배양 100mm 접시	Olympus 플라스틱	25-202
조직 배양 150mm 접시	Olympus 플라스틱	25-203
조직 배양 플라스크 T75	코 닝	430720U
50 mL 코니컬 튜브	코 닝	제430290
Plasmids: lentiviral transfer vector (렌티바이러스 전달 벡터	Verma Lab Salk 생물학 연구소
렌티바이러스 패키징 벡터	pMDL, pRev 및 pVSVG	K4975-00
내독소 무함유 맥시렙	Endo-free Maxiprep Kit Qiagen	12632
1X— HBSS	인비트로젠	제14025-092
15cm 조직 배양 접시
0.45μm 필터 장치, 500mL 용량
원뿔형 바닥 초원심분리 튜브	베크만	358126
둥근 바닥 초원심분리 튜브	베크만	326819
24웰 조직 배양 플레이트
형광 현미경
멀티채널 피펫터
ELISA 마이크로플레이트 리더

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