약물 치료 연구를 위한 뇌종양 줄기세포(BTSC) 이동 분석: BTSC의 이동에 대한 약물 치료의 효과를 분석하기 위한 체외 생세포 이미징 기법

초록

출처: Restall, I. et al. 교모세포종, 뇌종양, 줄기세포, 이동 및 침입을 연구하기 위한 생세포 이미징 분석. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 화학주성 이동 플레이트를 사용하여 살아있는 뇌종양 줄기세포의 이동에 대한 관심 약물의 효과를 분석하기 위해 뇌종양 줄기세포 이동 분석을 수행합니다. Live-cell imaging은 분석 중 세포 이동의 시각화 및 정량화를 용이하게 합니다.

프로토콜

1. 뇌종양 줄기세포 이동 분석

1. 이동 분석을 수행하기 1-2주 전에 8mL의 완전한 배지에 T25 플라스크의 세포 200,000개를 시딩합니다.
   메모: 도금과 분석 수행 사이의 시간은 사용된 BTSC 배양의 성장률에 따라 달라집니다.
   1. 이동에 대한 약물 처리의 효과를 테스트하기 위해, DMSO와 같은 적절한 비히클 및 관심 약물로 세포를 전처리하려면 해당 부피의 비히클 또는 약물 원료를 세포를 포함하는 배지의 별도 웰에 직접 첨가합니다.
2. 화학주성 이동 플레이트(그림 1A)를 얇은 콜라겐 층으로 코팅하여 준비합니다.
   1. 콜라겐으로 코팅해야 하는 96웰 화학주성 플레이트의 웰 수를 계산합니다. 각 조건에 대해 최소 3개의 반복 웰을 포함합니다.
   2. 배양 등급 물에서 0.14%로 희석된 순수 아세트산에서 유형 I 콜라겐 스톡 5mg/mL를 0.2mg/mL로 희석합니다.
   3. 0.2 mg/mL의 콜라겐을 멤브레인 인서트 웰과 사용 중인 하단 reservoir 웰 모두에 피펫팅합니다.
      메모: 플레이트의 하단 저장소에는 225μL가 필요하고 멤브레인 삽입 웰에는 적절한 코팅을 위해 75μL의 콜라겐이 필요합니다.
   4. 마이그레이션 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다.콜라겐 코팅을 긁지 않고 웰에서 콜라겐 용액을 흡입합니다.
   5. 멸균 1x PBS로 웰을 2x 세척합니다. 플레이트를 바로 사용하지 않는 경우 PBS를 흡인하고 4°C에서 최대 2주 동안 보관하십시오. 사용하기 전에 화학주성 이동 플레이트를 실온으로 예열합니다.
3. 화학주성 이동 플레이트의 하단 저장소를 준비합니다.
   1. 화학유인물질로 10% FBS가 보충된 225μL의 배지(성장 인자 제외)를 화학주성 마이그레이션 플레이트의 하단 저장소 웰에 피펫으로 넣습니다.
   2. 기포가 생성되지 않도록 멤브레인 인서트를 비스듬히 하단 저장소에 부드럽게 놓습니다.
4. 세포를 화학주성 이동 플레이트의 멤브레인 삽입물에 플레이트화합니다.
   1. 해리된 BTSC를 배지(성장 인자 없음)에서 50,000 cells/mL의 세포 밀도로 재현탁합니다. 다양한 약물 치료 중 이동을 평가하는 경우 미디어에 약물을 추가합니다. 또는 동일한 수의 전처리된 세포와 대조 세포를 파종하는 동시에 도금 시 최종 약물 농도를 유지합니다.
   2. 원하는 처리 조건에서 1.4.1단계에서 BTSC의 50μL를 마이그레이션 플레이트의 각 웰에 플레이트합니다.
5. 화학주성 이동을 이미지화합니다.
   1. 화학주성 마이그레이션 플레이트를 라이브 셀 이미징 시스템에 배치하고 최대 72시간 동안 1-2시간마다 플레이트의 현미경 이미지를 획득하도록 자동 이미징 소프트웨어를 설정합니다. 상용 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 타임라인을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스캔 간격을 24시간 동안 2시간 간격으로 설정합니다.
      메모: 시간 간격과 총 경과 시간은 사용된 BTSC 배양에 따라 다릅니다. 개별 BTSC 배양에 대한 경험을 쌓을 때까지 72시간 동안 2시간 간격으로 시작합니다. 자동 이미징 시스템을 사용할 수 없는 경우, 이미징 소프트웨어에 연결된 현미경과 카메라를 사용하여 동일한 시야의 이미지를 수동으로 획득할 수 있습니다.
   2. 이미지 획득이 완료되면 전체 실험에 대한 이미지를 얻고 멤브레인 및 이동 기공의 배경에서 세포를 구별하는 분석 소프트웨어를 사용하여 처리 정의를 생성합니다(그림 1B, 빨간색 마스크). 상용 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 새 처리 정의를 선택하고 BTSC에 대한 처리 정의 설정을 시드 임계값 52, 성장 임계값 85, 크기(픽셀) -1 조정, 최소 면적 200μm²로 설정합니다. 이 처리 정의를 멤브레인의 바닥면에 적용합니다. 배경막과 세포를 정확하게 구분하지 못하는 경우 이 분석을 수정하십시오.
   3. 3개의 복제 웰 각각에 대해 멤브레인 바닥의 세포 표면적으로 데이터를 수집하며, 이는 기공을 통해 이동한 세포만 계산합니다. 시간 경과에 따른 세포의 이동을 μm²(마이그레이션된 세포 면적) 단위로 그래프로 표시합니다(그림 1C).
      메모: 첫 번째 시점에 멤브레인의 상단 표면에 도금되고 계수된 세포의 상대적 수가 고르지 않은 도금의 영향을 피하기 위해 모든 처리 조건 간에 유사한지(모든 웰에서 20% 미만의 변동) 확인합니다. 상용 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용한 데이터 수집은 1.5.2단계에서 생성한 처리 정의를 시작하고 메트릭스, 그래프/내보내기, 데이터 내보내기를 차례로 클릭하여 실행할 수 있습니다.

결과

그림 1: BTSC 이동의 라이브 셀 이미징.(A) 이는 BTSC로 이동 분석을 수행하기 전에 얇은 I형 콜라겐 층으로 코팅된 96웰 화학주성 이동 플레이트의 예입니다. 이미지는 i) 세 부분(뚜껑, 멤브레인 인서트 및 저장소)이 모두 함께 배치된 플레이트, ii) 세 부분이 모두 분리된 플레이트, iii) 멤브레인 삽입물의 상부 모습의 클로즈업 이미지, iv) 멤브레인 인서트의 바닥 뷰의 클로즈업 이미지, v) 하단 저장소의 클로즈업 이미지. (B) 이들은 실험 시작(0시간) 및 24시간 시점의 BTSC 이동을 보여주는 대표적인 이미지입니다. 이미지 초점은 세포가 원래 도금된 멤브레인 인서트의 상단에 있습니다. 화학주성 이동 플...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마트리겔 매트릭스	코 닝	제356230
96웰 플레이트	에펜도르프	30730119
T25 Nunc EasYFlask	써모피셔	156367
Falcon 15 mL 코니컬 튜브	써모피셔	352096
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis 플레이트	에센 바이오사이언스	4582
IncuCyte Zoom 라이브 셀 분석 시스템	에센 바이오사이언스	4545
IncuCyte Zoom 라이브 셀 분석 소프트웨어	에센 바이오사이언스	2016A 레브1
인산염 완충 식염수(PBS)	시그마	D8537
배양 등급 물	론자 바이오휘태커	17-724큐
소 태아 혈청(FBS)	인비트로젠	제12483-020
랫 콜라겐 I	트레비겐	Tel.: 3440-100-01
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