뇌종양 줄기세포(BTSC) 신경구 침입 분석: 신경영역에서 BTSC 침입에 대한 약물 치료의 효과를 분석하기 위한 체외 분석

초록

출처: Restall, I. et al. 교모세포종 뇌종양 줄기세포 이동 및 침입을 연구하기 위한 생세포 이미징 분석. J. Vis. 특급.(2018년)

이 비디오는 생체 외 뇌종양 줄기세포(BTSC) 침입 분석을 통해 생체 세포 이미징 기술을 통해 신경계에서 BTSC의 침입 능력에 대한 약물 치료의 효과를 확인하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 뇌종양 줄기세포 신경구 침입 분석

1. 침입 분석을 수행하기 1-2주 전에 T25 플라스크의 8mL 완전 배지에 200,000개의 세포를 시딩합니다.
   메모: 도금에서 분석 수행까지의 타이밍은 사용된 BTSC 배양의 확산 속도에 따라 달라집니다.
   1. 전처리된 세포의 경우, 신경구가 침입을 위해 도금될 준비가 되기 전에 미리 결정된 시간 경과 동안 원하는 농도로 플라스크에 관심 화합물을 추가합니다.
2. 평균 신경구 크기가 약 150–200 μm가 될 때까지 기다립니다. 일반적으로 사용되는 BTSC 배양에 따라 7-14일이 소요됩니다.
   메모: 플라스크에서 구 크기의 분포를 관찰하는 것이 일반적입니다.
3. 팁과 플라스크를 피펫으로 부드럽게 혼합하고 각 처리 조건에 대해 500μL의 BTSC 신경구를 1.5mL 원뿔형 튜브로 이동합니다. 이는 3개의 복제 웰을 플레이팅하는 데 사용됩니다.
   참고: 1.3.1–1.3.2 단계는 선택 사항이지만 새로운 BTSC 배양에 대한 첫 번째 침입 실험에 권장됩니다.
   1. 웰에서 끝날 신경구의 밀도를 확인하려면 1.3단계와 같이 1.5mL 튜브를 준비합니다. 신경구를 부드럽게 혼합하고 100μL를 별도의 96웰 플레이트로 이동하고 신경구가 5분 동안 중력에 의해 정착하도록 합니다.
   2. 현미경으로 신경구체의 수를 확인하여 여러 신경구체가 과밀하지 않고 이미지화될 우물 영역에 있는지 확인합니다.
      메모: 침입하는 신경구체는 이웃 신경구체와 상호 작용하지 않고 직경이 3배로 커질 수 있는 충분한 공간이 필요합니다. 웰당 신경구의 수는 웰당 신경구의 수를 세고 1.3단계에서 T25 플라스크에서 1.5mL 원추형 튜브에 더 많거나 더 적은 신경구를 추가하여 조정할 수 있습니다.
4. 1.5mL 원뿔형 튜브와 1.3단계의 세포를 얼음 위에 놓고 1.5–1.7단계를 얼음 위에 놓습니다.
5. 신경구를 중력에 의해 1.5mL 원뿔형 튜브의 바닥에 5분 동안 가라앉히고 라벨이 붙은 96웰 플레이트를 얼음 위에서 예냉각합니다.
6. 세포외 기질 단백질의 신경구를 재현탁합니다.
   1. 각 처리 조건에 대해 얼음에 0.4mg/mL 유형 I 콜라겐 용액 500μL를 준비합니다: 배지 459μL(성장 인자 제외), 5mg/mL 콜라겐 스톡 용액 40μL 및 멸균 1N NaOH 0.92μL를 추가합니다(표 1).
      참고: 처리 조건당 500μL의 콜라겐 용액이 필요합니다: 3개의 복제 웰 각각에 대해 100μL 및 200μL의 초과분. 약물 처리는 용액의 매체 성분에서 뺀 원하는 최종 농도에서 여기에 추가해야 합니다. 이 프로토콜은 세포 외 기질 단백질로 유형 I 콜라겐의 사용을 설명합니다. 그러나 모든 세포외 기질 단백질을 테스트할 수 있습니다. 또한, 침입 속도가 느린 BTSC 배양의 경우, 성장 인자 또는 FBS를 배지에서 보충하여 침입 속도를 높일 수 있습니다.
   2. 1.5단계의 신경구가 가라앉은 후, 바닥에 가라앉은 신경구 펠릿을 잃지 않고 가능한 한 많은 매체를 흡인합니다. 1.6.1단계에서 준비한 콜라겐 용액 500μL에 신경구를 부드럽게 재현탁합니다.
7. 콜라겐 및 신경구 혼합물 100μL를 얼음 위의 96웰 플레이트의 복제 웰 3개에 추가합니다. 신경구가 5분 동안 얼음 위에 가라앉도록 합니다.
8. 96웰 플레이트를 37°C 인큐베이터로 5분 동안 옮겨 콜라겐 중합을 가능하게 합니다.
9. 즉시 96웰 플레이트를 이미지화할 준비를 합니다.
   1. 96웰 플레이트를 라이브 셀 이미징 시스템의 트레이 또는 현미경 스테이지에 놓아 침공이 시작되기 전에 도금 시 신경구 크기에 대한 참조로 이미지를 획득합니다.
   2. 침입 속도가 안정될 때까지 매시간 이미지를 획득합니다. 일반적으로 이는 24시간 이내에 발생합니다.
      메모: 이미징 간격은 사용 중인 장비에 따라 변경될 수 있습니다. 이미징 간격 및 총 경과 시간은 침입 속도가 다른 BTSC 배양에 대해서도 수정할 수 있습니다.
10. 시간이 지남에 따라 BTSC가 매트릭스를 침범할 때 증가하는 표면적을 확인합니다.
    메모: 3개의 복제 웰의 평균으로 계산되는 도금 시점의 세포 표면적은 BTSC 침습의 차이가 플레이팅된 신경구의 수나 크기에 의해 크게 영향을 받지 않도록 하기 위해 서로 다른 처리 조건 간에 유사해야 합니다(모든 웰에서 20% 미만의 변동).
    1. 라이브 셀 분석 시스템의 경우, 이미지 획득을 위해 10X 대물렌즈를 사용하고 3개의 복제 웰에 대해 웰당 4개의 이미지를 획득합니다. 웰의 합류 퍼센트로 표시되는 상대적인 세포 표면적을 결정하려면 웰의 배경에서 세포를 구체적으로 강조하는 처리 정의를 설정하십시오. 상용 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 새 처리 정의를 선택하고 세분화 조정을 0.8, 최소 면적을 300μm², 최대 편심을 0.99로 설정합니다. 배경과 셀을 정확하게 구분하지 못하는 경우 이 분석을 수정합니다.
       메모: 시간 경과에 따른 신경구 침입을 이미지화하기 위해 다른 방법을 사용하는 경우 시간이 지남에 따라 3개의 복제 우물에 대한 여러 시야를 얻는 것이 좋습니다. 그러나 각 간격에서 정확히 동일한 시야를 이미징하지 않으면 수집된 데이터의 표준 오류가 증가합니다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 각 이미지에서 침입하는 세포의 표면적을 측정할 수 있습니다.
    2. 각 시점의 모든 웰에 대한 총 세포 표면적(상대 또는 절대)으로 데이터를 수집하고 3개의 복제 웰의 평균을 결정합니다. 시간이 지남에 따라 증가하는 세포 면적을 그래프로 표시하여 BTSC의 침입을 그래프로 표시합니다.

개 개 명 의 호 명

콜라겐 용액 준비
스톡 [콜라겐] (mg/mL)	5
최종 [콜라겐] (mg/mL)	0.4
필요한 우물 수:	5
총 부피(μL)	500
스톡 콜라겐의 부피 (μL)	40
1N NaOH의 부피 (μL)	0.92
매체의 부피(μL)	459

표 1: 0.4 mg/mL 유형 I 교원질 해결책의 준비. 유형 I 교원질 해결책의 알려진 시작 그리고 원한 마지막 농도는 목록으로 만들어진다. 나열된 부피는 신경구를 3개의 복제 웰과 초과분에 대한 2개로 플레이트화하기에 충분하며, 프로토콜 단계 1에 자세히 설명된 바와 같이 단일 처리 조건을 포함할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
랫 콜라겐 I	트레비겐	Tel.: 3440-100-01
나오	폭스바겐	BDH3247-1
아세트산	밀리포어 시그마	AX0073-6
96웰 플레이트	에펜도르프	30730119
T25 Nunc EasYFlask	써모피셔	156367
Falcon 15 mL 코니컬 튜브	써모피셔	352096
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis 플레이트	에센 바이오사이언스	4582
IncuCyte Zoom 라이브 셀 분석 시스템	에센 바이오사이언스	4545
IncuCyte Zoom 라이브 셀 분석 소프트웨어	에센 바이오사이언스	2016A 레브1
페니실린, 스트렙토마이신	시그마	P4333
인산염 완충 식염수(PBS)	시그마	D8537
소 태아 혈청(FBS)	인비트로젠	제12483-020

년 년 호