패턴화된 뉴런에서 교모세포종 세포 공동 배양: 체외에서 쥐 해마 뉴런에서 교모세포종 세포의 이동을 모니터링하는 기술

초록

출처: Guyon, J. et al. 이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위한 패턴화된 뉴런에서 교모세포종 줄기 유사 세포의 공동 배양. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오는 교모세포종 줄기 유사 세포가 종양 주위 공간의 뉴런을 타고 이동할 때 수초화된 신경관 침입을 모방한 미세 패턴의 뉴런에서 교모세포종 세포의 공동 배양 분석을 설명합니다. 이 분석은 신경교종의 뉴런에 대한 교모세포종 세포의 이동을 억제하는 약리학적 약물의 효과를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 패턴이 있는 슬라이드 준비

1. 마이크로패터닝을 위한 기판 준비
   1. 18mm 원형 유리 커버슬립을 공기/플라즈마 활성화로 5분 동안 처리합니다. 커버슬립을 100μL(3-아미노프로필) 트리에톡시실란이 있는 밀폐된 챔버에 데시케이터에 1시간 동안 놓습니다.
   2. 100mM 탄산염 완충액, pH > 8에서 100mg/mL의 폴리(에틸렌 글리콜)-숙시니미딜 발레레이트(분자량 5,000(Peg-SVA))로 1시간 동안 배양합니다.초순수로 광범위하게 헹구고 화학 후드 아래에서 건조시킵니다.
      메모: 이 단계에서 샘플은 나중에 사용할 수 있도록 어두운 곳에서 4°C에 보관할 수 있습니다.
   3. 인산염 완충 식염수(PBS)에 14.7mg/mL의 광개시제인 4-벤조일 벤조일 트리메틸암모늄 클로라이드(PLPP)를 추가합니다<> 메모: PLPP의 농축 형태인 PLPP 젤도 사용할 수 있습니다. 그 결과 PEG 브러시를 저하시키는 데 필요한 자외선(UV) 조명 시간이 짧아집니다(100mJ/mm²).
2. Photoinitiator 겔 증착
   1. 3 μL의 PLPP 겔과 50 μL의 앱솔루트 에탄올의 혼합물을 준비하여 슬라이드 중앙에 증착합니다. 절대 에탄올이 완전히 증발할 때까지 샘플을 화학 후드 아래에 놓습니다.
      메모: 이 단계에서 샘플은 나중에 사용할 수 있도록 어두운 곳에서 4°C에 보관할 수 있습니다.
3. 유리 슬라이드 마이크로 패터닝
   1. 커버슬립을 Ludin 챔버에 장착하고 자동 초점 시스템이 장착된 현미경의 전동 스테이지에 놓습니다.
   2. 구상된 마이크로 패턴에 해당하는 이미지를 소프트웨어에 로드합니다. 복제 4 x 4 회, 간격 200μm, 자외선 선량 1,000 mJ/mm² 등의 매개변수를 적용합니다. 자동 UV 조명 시퀀스 후 여러 PBS 세척으로 PLPP를 헹굽니다.
      메모: PLPP 젤을 사용한 경우 탈이온수로 충분히 세척하여 제거하고_N2 흐름에서 건조시킨 후 4°C에서 보관하십시오.
   3. 라미닌(PBS에서 50μg/mL)으로 30분 동안 배양하고 PBS로 광범위하게 세척합니다.
      참고: 정제된 녹색 형광 단백질(GFP, PBS의 경우 10μg/mL)의 형광 용액을 라미닌과 혼합하여 형광 현미경으로 미세패턴을 시각화할 수 있습니다.

2. 공동 배양을 위한 뉴런 및 GBM 세포 준비

1. 배아 쥐 해마 뉴런의 배양
   1. 배아(E18) 쥐의 해마를 해부하고 조직을 15mL 튜브에 Hank's balanced salt solution(HBSS)/1mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)/penicillin-streptomycin 용액으로 옮깁니다. 해마를 건조시키지 않고 과도한 용액을 제거하십시오.
   2. 페니실린(10,000 units/mL)/스트렙토마이신(10,000 μg/mL) 및 1 mM HEPES가 보충된 트립신-에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA) 5mL를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.HBSS/HEPES/페니실린-스트렙토마이신 용액으로 2x 세척하고 조직을 이 용액에 2-3분 동안 그대로 둡니다.
   3. 두 개의 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 조직을 위아래로 10회 피펫팅하여 거품을 최소화하도록 주의하여 조직을 해리합니다. 세포를 계수하고 세포 현탁액의 생존력을 평가합니다. 아래와 같이 마이크로 패턴의 커버 슬립에 뉴런을 도금합니다 .
      메모: 추출 후 세포 생존율은 85–90%입니다.
2. Micropatterned Coverslips의 뉴런 에 대한 세포 배양
   1. 마이크로패턴 유리 슬라이드를 PBS로 재수화하고 완전한 신경 세포 배양 배지를 배양합니다.
   2. E18 Sprague-Dawley 쥐에서 얻은 해마 뉴런을 3% 말 혈청이 풍부한 NBM(Neurobasal Medium)에서^cm2당 50,000개의 세포 밀도로 마이크로 패턴 유리 커버슬립 바로 위에 파종합니다. 마이크로패턴화된 뉴런을 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 48시간 동안 놓습니다.
      메모: ~6시간 후, 일차 해마 뉴런이 라미닌 미세패턴에 부착되는 것을 볼 수 있습니다.
3. 뉴런에서 인간 교모세포종 줄기 유사 세포의 공동 배양
   1. 스페로이드 모양의 세포가 현탁액에서 성장함에 따라 200 × g에서 5분 동안 현탁액을 원심분리합니다. 5mL의 PBS로 스페로이드를 세척하고 37°C에서 5분 동안 0.5mL의 세포 해리 시약(재료 표 참조)으로 세포를 배양합니다.
   2. 4.5mL의 완전한 NBM(앞서 설명한 바와 같이 B27 보충제, 헤파린, 섬유아세포 성장 인자 2, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보완됨)을 추가하고 자동 계수 기술을 사용하여 세포를 계수합니다.
   3. 3% 말 혈청이 풍부한 NBM의 미세 패턴 신경 세포 배양 위에 1,000개의 GBM 세포를 파종합니다. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(3-아미노프로필) 트리에톡시실란	시그마	440140-100ML	아미노기는 mPEG-SVA의 생체접합에 유용합니다.
96웰 라운드 바텀 플레이트	사르슈테트	2582624	스페로이드를 준비하는 데 사용됩니다.
아카쿠타아제	지브코	A11105-01	-20°C(장기) 또는 4°C(단기)에서 보관, 구 해리 효소
나27	지브코	12587	-20 °C에서 보관, 사용 전 해동
Basic Fibroblast 성장 인자	페프로텍	100-18B	-20 °C에서 보관, 사용 전 해동
Countess Cell Counting Chamber 슬라이드	인비트로젠	C10283	세포 계수에 사용됨
커버슬립	마리엔펠트	111580	세포 배양 기질
데시케이터 카트리지	시그마	Z363456-6개	(3-아미노프로필) 트리에톡시실란 처리 중 수분을 줄이기 위해 사용
DPBS 10배	(주)팬바이오텍	전화04-53-500	4 °C에서 보관
플라스크 75 cm²	송골매	10497302
HBSS (하이브에스)	시그마	H8264-500ML
헤파린 나트륨	시그마	H3149-100구	4 °C에서 보관
라미닌		114956-81-9	신경 세포 접착 촉진
플라스크 75 cm²	송골매	10497302
헤파린 나트륨	시그마	H3149-100구	4 °C에서 보관
레오나르도 소프트웨어			구상된 마이크로패턴의 로딩
MetaMorph 소프트웨어	분자 장치 LLC	해당 없음	현미경 자동화 소프트웨어
메틸셀룰로오스	시그마	M0512	2% 최종 농도를 위해 NBM에서 희석
Neurobasal 배지	지브코	제21103-049	4 °C에서 보관
니콘 TiE(S 형광, 20x/0.75NA)			전동 스테이지가 장착된 도립 현미경
페니실린 - 스트렙토마이신	지브코	15140-122	4 °C에서 보관
PLPP	폐포		PEG 브러시를 분해하는 데 사용되는 광개시
폴리(에틸렌 글리콜)-숙시니미딜 발레레이트(mPEG-SVA)	레이산 바이오	VA-페그-VA-5000-5g	방오 코팅으로 사용
트립신-EDTA	시그마	T4049-100ML	부착 세포를 분리하는 데 사용됩니다

년 년 호 년 (영문) 제 .