1차 뇌 주피세포의 분리 및 배양: 내피 세포 오염 없이 소 뇌 모세 세포에서 주피 세포를 분리하고 배양하는 절차

초록

출처: Hørlyck, S. et al. 세포질 칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 주피 세포의 배양.J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오에서는 내피 세포 오염 없이 소의 뇌 모세혈관에서 주위 세포를 분리하고 배양하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 소 모세혈관의 파종 및 배양

1. 0일차: 콜라겐 IV 스톡 0.7mL와 PBS 6.3mL를 혼합합니다. 용액을 T75-플라스크에 넣고 플라스크를 실온(RT)에서 2시간 동안 그대로 두거나 4°C에서 밤새 그대로 둡니다.
2. 플라스크에서 콜라겐 용액을 제거하고 PBS로 3회 세척합니다.
3. 피브로넥틴 작업 용액 7mL를 추가하고 플라스크를 RT에서 30분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 피브로넥틴 용액을 제거하고 그 직후에 모세혈관을 파종합니다.
4. 30분의 대기 시간 동안 37°C 수조에서 모세관 한 바이알을 해동합니다.
5. 모세관이 해동되면 즉시 DMEM-comp 30mL가 있는 원심분리 튜브로 옮기고 500 x g 및 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.튜브에서 DMEM-comp를 제거하고 새로운 DMEM-comp 10mL에 모세관 펠릿을 재현탁합니다.
6. 10mL 현탁액을 코팅된 T75-플라스크로 옮기고 10% CO₂.
   의 37°C 인큐베이터에서 4-6시간 동안 모세혈관이 플라스크 바닥에 부착되도록 둡니다. 메모: 세포 성장률은 기존의 5%_CO2보다 10%_CO2에서 더 높습니다.
7. 4-6시간의 배양 후 광학 현미경으로 플라스크를 검사합니다. 이제 모세혈관의 분획이 플라스크 바닥에 부착되어야 합니다(그림 1, 0일차).
8. GM을 준비하고 모세혈관에서 DMEN-comp 배지를 매우 조심스럽게 흡인하고 갓 만든 GM 10mL로 교체합니다.
9. 2일차: 모세혈관에서 GM을 제거하고 새로 만든 GM 10mL로 교체합니다. 이 시점에서 모세혈관에서 세포 분양이 광학 현미경으로 보여야 합니다(그림 1, 2-3일차).

2. 소 뇌 모세 혈관에서 1 차 pericytes의 분리

1. 4일차: 광학 현미경으로 모세혈관을 검사합니다.
   메모: 이제 플라스크는 적절한 양의 pericyte를 제공하기 위해 약 60–70%의 합류도를 가져야 합니다(그림 1, 4일차). 그렇지 않은 경우; GM을 10mL의 새 배지로 교체하고 플라스크를 인큐베이터에 하루 더 두십시오.
2. 배지를 흡인하고 PBS에서 세포를 부드럽게 세척합니다.
3. 내피 세포를 위해 해동된 트립신-EDTA 2mL를 추가하고 플라스크를 1-3분 동안 인큐베이터에 그대로 둡니다. 플라스크를 자주 꺼내 이 시간 동안 현미경으로 관찰하십시오.
   메모: 내피 세포는 둥글게 모여 플라스크에서 분리되어야 합니다. 주피세포는 "고스트" 형태를 가진 세포로 보여야 하며 여전히 플라스크 표면에 부착되어 있어야 합니다.이것은 까다롭고 중요한 단계입니다.주피세포 단일배양(pericyte monoculture)의 오염을 피하기 위해 대부분의 내피 세포를 제거하는 것이 필수적이지만, 트립신화(trypsinization)가 장기화되면 주피세포가 분리될 수도 있습니다. 트립신화 시간은 때때로 약간 달라질 수 있으므로 처리 중 현미경으로 플라스크를 자주 관찰하는 것이 가장 중요합니다.
4. 내피 세포가 둥글어지기 시작하면 플라스크를 부드럽게 두드려 느슨해진 내피 세포를 분리합니다.
5. 트립신화를 중지하려면 플라스크에 DMEM-comp 10mL를 추가합니다. 배지로 플라스크를 조심스럽게 몇 번 세척하여 내피 세포를 제거합니다. 플라스크에서 내피 세포 현탁액을 흡인합니다. 내피 세포는 이제 다른 용도로 사용할 수 있습니다.
6. 플라스크에 DMEM-comp 10mL를 추가합니다. 광학 현미경 아래를 보고 pericyte가 여전히 존재하고 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다. 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣어 주피세포가 풍부한 배양이 자랄 수 있도록 합니다.
   메모: 다음 날 동안 문화를 관찰하는 것이 중요합니다. 여전히 상당한 수의 내피 세포가 성장하고 있는 경우 다른 트립신 치료를 수행할 수 있습니다.
7. pericyte monoculture가 2일에 한 번씩 DMEM-comp. 배지의 변화에 따라 성장할 수 있도록 합니다. 광학 현미경으로 세포의 성장을 확인합니다(그림 1, 5-8일차).

결과

그림 1: 모세혈관 배양 및 주위 세포의 분리.모세혈관은 신선한 소의 뇌에서 분리되어 0일차에 배양 플라스크에 파종되었습니다. 소의 뇌 모세혈관에서 나온 성장과 그에 따른 주피세포의 분리를 광학 현미경으로 며칠에 걸쳐 추적했습니다. Day 4a는 내피 세포를 제거하기 위해 trypsin을 투여한 치료 전의 내피 세포 성장을 보여주고, day 4b는 치료 직후의 잔여물을 보여줍니다. 8a일차는 모세혈관 잔해가 보이는 초점면을 보여주는 반면, 8b일차는 주피세포의 성장이 보이는 평면에 초점이 맞춰져 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS (PBS)	시그마 알드리치	D8537	인산염 완충 식염수
콜라겐 IV	시그마 알드리치	C5533
T-75 플라스크	시그마 알드리치	CLS3972
소 태아 혈청(FBS)	PAA/GE 헬스케어	대답15-101
피브로넥틴	시그마 알드리치	F1141
트립신-EDTA	시그마 알드리치	T4299
광학 현미경	올림푸스	올림푸스 CK2	위상차가 있는 정립 광학 현미경
디엠소	시그마 알드리치	471267
덤플링을	시그마 알드리치	H3149
세포 배양기	써모 피셔
원심 분리기	써모 피셔	헤레우스 멀티퓨지 3SR+	세포 방사를 위한 표준 대용량 원심분리기
Dulbecco의 변형 독수리 미디엄	시그마 알드리치	D0819
페니실린 G 나트륨/스트렙토마이신 설페이트	시그마 알드리치	P0781
MEM 비필수 아미노산	시그마 알드리치	M7145