출처: Hartz, A. M. S. et al. 신선한 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관 분리. J. Vis. 특급 (2018년)
이 비디오는 새로운 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 분리된 모세혈관을 사용하여 체외 혈액 뇌 장벽 모델을 생성할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
인간 뇌에서 대뇌 모세혈관 분리: 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관을 추출하는 최적화된 방법
3.1K 조회수
⸱
2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 뇌 샘플 준비
참고: 그림 1A는 아래에 설명된 전체 격리 절차의 워크플로우 차트를 보여줍니다. 인간의 뇌 조직은 피질의 어느 부분에서나 유래할 수 있으며 신선하거나 냉동된 상태로 사용할 수 있습니다. 얼어붙은 뇌 조직은 실온에서 해동할 수 있습니다(완충액 없음, 10g의 경우 ~30분). 비교 가능한 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 동일한 뇌 영역에서 뇌 조직을 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 동결되지 않은 신선한(사후 간격 또는 PMI<4시간) 인간 대뇌 피질에 최적화되어 있습니다.
- 인간 뇌 조직의 준비: 뇌 조직의 무게를 문서화합니다. 다음 프로토콜의 모든 숫자는 신선한 인간 뇌 조직 10g에 적합합니다. 뇌 조직을 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 집게로 모든 수막을 조심스럽게 제거하십시오. 메스를 사용하여 백질을 잘라냅니다.
- 인간 뇌 조직 다지기: 뇌 조직을 조심스럽게 잘라 메스로 다집니다. 약 5분(2-3mm 조각) 동안 다집니다. 뇌 조직을 Potter-Elvehjem 조직 분쇄기로 옮깁니다. 30mL의 분리 버퍼를 추가합니다.
메모: 다진 조직 조각은 다진 과정을 통해 뇌 조직이 뭉개지기 때문에 보기 어렵습니다.
2. 균질화
- Potter-Elvehjem 조직 분쇄기(간격: 150–230 μm): 50rpm의 균질화 속도에서 100번의 스트로크로 각 샘플을 균질화합니다. 25스트로크마다 경과한 시간과 100회 스트로크에 필요한 총 시간을 문서화합니다. 제안된 균질화 프로토콜에 대해서는 표 1을 참조하십시오. 인간 전두엽 피질 10g을 균질화하는 데 걸리는 총 시간은 약 22분입니다. 거품을 방지하기 위해 공기 중에서 저어주지 마십시오.
- Dounce 균질화기(간격: 80–130μm): 균질화를 얼음 위의 Dounce 균질기로 옮깁니다. 서스펜션을 20스트로크(~6초/스트로크, 총 ~2분)로 균질화합니다. 거품을 피하십시오.
3. 원심분리
- 뇌 균질액을 4개의 50mL 원심분리 튜브에 균등하게 분배하고 균질액의 총 부피를 문서화합니다. 50mL의 밀도 구배 완충액을 원심분리 튜브에 분배합니다(튜브당 12.5mL). 10mL의 분리 버퍼를 사용하여 유봉과 균질기를 헹구고 4개의 원심분리 튜브(튜브당 ~2.5mL)에 분배합니다.
- 캡으로 원심분리기 튜브를 단단히 닫습니다.균질화, 밀도 구배 매체 및 튜브를 세게 흔들어 버퍼를 혼합합니다. 5,800 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기(고정각 로터); 중간 감속 속도를 선택하여 펠릿이 튜브에 부착된 상태를 유지합니다. 상등액을 버리고 각 펠렛을 1% BSA 2mL에 재현탁합니다.
4. 여과
참고: 적혈구 및 기타 세포 파편에서 모세혈관을 분리하려면 몇 가지 여과 단계가 필요합니다.
- 300μm 메쉬: 펠릿을 재현탁한 후 300μm 메쉬를 통해 현탁액을 필터링합니다. 모세혈관은 그물망을 통해 걸러지는 반면, 더 큰 혈관과 더 큰 뇌 파편은 그물망에 남아 있습니다. 최대 50mL의 1% BSA로 메쉬를 조심스럽게 세척합니다. 메시를 버립니다.
메모: 이 여과 단계는 더 큰 혈관이나 뇌 파편 덩어리에서 모세관 현탁액을 제거합니다. - 30μM 셀 변형 필터
메모: 이 여과 단계는 모세혈관을 적혈구 및 기타 뇌 파편에서 분리합니다.- 4.1단계의 모세관 여과액을 5개의 30μm 세포 변형 필터(세포 변형 필터당 약 10mL의 모세관 여과액)에 분배합니다. 모세혈관은 이 필터에 의해 억제되는 반면, 적혈구, 다른 단세포 및 작은 뇌 파편은 필터를 통과하여 여과액에 수집됩니다.
- 각 필터를 1% BSA 25mL로 세척합니다. 그런 다음 모든 여과액을 여섯 번째 필터에 부어 수율을 높입니다. 각 필터를 50mL의 1% BSA로 세척합니다. 모세혈관을 포함하는 세포 균주 필터를 유지하고 여과액을 폐기하십시오.
5. 모세관 수집
- 필터를 거꾸로 뒤집어 각 필터에 대해 50mL의 1% BSA로 모세관을 50mL 튜브로 세척합니다. 5mL 피펫터의 피펫 끝으로 부드럽게 압력을 가하고 필터를 가로질러 이동하여 뇌 모세혈관을 씻어냅니다.
- 특히 필터 가장자리에서 모든 뇌 모세혈관을 씻어내십시오. 기포는 여과 과정을 더 어렵게 만들고 모세관 손실 가능성을 높이므로 피하십시오.
6. 세탁
- 모세관을 채취한 후 1,500 x g의 모든 샘플을 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다(스윙 버킷 로터). 상층액을 제거하고 약 3mL의 분리 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 15mL 코니컬 튜브에 하나의 샘플에서 재현탁된 모든 펠릿을 결합하고 분리 버퍼로 채웁니다. 다시 1,500 x g에서 4°C에서 3분 동안 원심분리기를 하고 두 번 더 세척합니다.
- 현미경(100X 배율)과 카메라(그림 1B)로 모세관 순도를 문서화합니다.
메모: 인간 뇌 조직 10g의 뇌 모세혈관 수율은 일반적으로 약 100mg입니다. 분리된 뇌 모세혈관은 이제 실험, 처리(예: 용해물, 멤브레인 분리)에 사용하거나 급속 동결 및 냉동 튜브에서 -80°C에서 최소 6-12개월 동안 보관할 수 있습니다(여러 번의 동결-해동 주기 방지).
| 스트로크 | 시간 |
| 1–25 | 7–7.5 |
| 26–50 | 5–5.5 |
| 51–75 | 5–5.5 |
| 76–100 | 5–5.5 |
| 총 시간: | 22–24 |
표 1: 균질화 프로토콜. Potter-Elvehjem 조직 분쇄기가 50rpm의 균질화 속도로 10g의 인간 전두엽 피질을 균질화하기 위한 균질화 프로토콜입니다. 처음 몇 번의 스트로크는 다진 조직을 균질화하는 데 추가 시간이 필요합니다. 이 초기 균질화 후 각 스트로크의 지속 시간은 12초입니다(하향 이동의 경우 6초, 상향 이동의 경우 6초). 따라서 초기 균질화 후 1분에 5스트로크 또는 5분에 25스트로크를 수행할 수 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
그림 1: 모세관 분리를 위한 순서도. (A) 픽토그램은 신선한 인간 조직에서 뇌 모세혈관을 분리하는 절차의 주요 단계를 보여줍니다. (B) 사진은 분리 직후 광학 현미경으로 분리된 인간 뇌 모세혈관을 보여줍니다(100X 배율).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 개인 보호 장비(PPE) | |||
| Diamond Grip Plus 라텍스 장갑, Microflex 미디엄 | VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국 | 32916-636 | 보호구 |
| 일회용 보호 랩코트 | VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국 | 470146-214 | PPE; 인체 원료의 특성으로 인해 일회용 실험실 코트를 사용하는 것이 좋습니다 |
| 페이스 쉴드, 사용 후 버릴 수 있습니다 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 19460102 | PPE; 인체 원료의 특성으로 인해 일회용 안면 보호대의 사용이 권장됩니다 |
| 안전 재료 | |||
| Clavies 고온 오토클레이브 백 8 x 12 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 01-815-6 | |
| Versi 드라이 벤치 용지 18" x 20" | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 14-206-32 | 작업 영역을 커버하기 위해 |
| VWR 샤프 컨테이너 시스템 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 75800-272 | 중고 메스의 경우 |
| 표백제 8.2% Clorox 살균 64 oz. | 영국 공급 센터, 렉싱턴, 켄터키, 미국 | 323775 | |
| 장비 | |||
| 4 °C 냉장고 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | Tel.: 13-986-148 | |
| Accume BASIC AB15 pH 측정기 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | AB15 | |
| 하이돌프 RZR 2102 컨트롤 | Heidolph, 엘크 그로브 빌리지, 일리노이, 미국 | 501-21024-01-3 | |
| Sorvall LEGEND XTR 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 75004521 | |
| Leica L2 해부 현미경 | Leica Microsystems Inc, 미국 일리노이주 버팔로 그로브 | 수막을 제거하는 데 사용됩니다. | |
| POLYTRON PT2500 균질화기 | Kinematica AG, 스위스 루체른 | 9158168 | |
| P-403 스케일 | Denver Instrument, 보헤미아, 뉴욕, 미국 | 191392 | |
| 표준 미니 교반 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 1151050 | |
| Thermo-Flasks 액체 질소 듀어 | Thermal Scientific, Mansfiled, 텍사스, 미국 | 11-670-4씨 | 조직을 동결하는 데 사용됩니다. |
| Voyager Pro 분석 저울 | 오하우스, 파시파니, 뉴저지, 미국 | VP214CN | |
| ZEISS 액시오베르트 마이크로코프 | Carl Zeiss, Inc Thornwood, 뉴욕, 미국 | 분리된 모세관을 확인하는 데 사용됩니다. | |
| 도구 및 유리 제품 | |||
| Finnpipette II 피펫 1-5 mL | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 21377823T1 | 필터에서 모세혈관 세척 |
| Finnpipette II 피펫 100-1,000 μL | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | 21377821T1 | BSA에서 펠릿 재현탁 |
| 피펫 보이 | Integra, Hudson, NH, 미국 | 739658 | |
| 50 mL Falcon 튜브 25/랙 - 500/cs | VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국 | 21008-951 | |
| EISCO 메스 블레이드 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | S95938C | 뇌 조직을 다지기 위해 |
| 파라필름 | VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국 | 52858-000 | 비커와 부피 플라스크를 덮기 위해 |
| Thermo Scientific 핀팁 피펫 팁 5 mL | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | Tel.: 21-377-304 | 필터에서 모세혈관을 씻어내려면 |
| 60 mL 주사기(Luer-Lok 포함 | Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그 | BD309653 | 모세관을 여과하기 위해 커넥터 링과 함께 사용 |
| 메스 손잡이 #4 | Fine Science Tools, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국 | 10060-13 | 다지기에 사용 |
| Dumont 집게 #5 | Fine Science Tools, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국 | 11251-10 | 수막을 제거하는 데 사용됩니다. |
| Potter-Elvehjem 티슈 그라인더 | Thomas Scientific, 미국 뉴저지주 스웨덴보로 | 3.43E+28 | 50 mL 용량, 간격: 150-230 μm |
| Dounce 균질화기 | VWR, 래드너 펜실베니아 미국 | 62400-642 | 15 mL 용량, 간격: 80-130 μm |
| 스펙트럼/메쉬 우븐 필터(300μm) | Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, 캘리포니아, 미국 | 146424 | 남아 있을 수 있는 수막을 제거하기 위해 모세관 현탁액을 여과하는 데 사용됩니다 |
| pluriStrainers (기공 크기 : 30 μm) | pluriSelect Life Science, 라이프치히, 독일 | Tel.: 43-50030-03 | |
| 커넥터 링 | pluriSelect Life Science, 라이프치히, 독일 | 41-50000-03 | 여러 번 재사용 |
| 1 L 용량 측정 플라스크 | 절연 버퍼 준비용 | ||
| 1L 비커 | 1% BSA 제조용 | ||
| 교반 바 | 1% BSA 및 Ficoll® 제조용 | ||
| Schott 병 (60mL) | Ficoll®의 준비를 위해 | ||
| 얼음 양동이 | 모든 것을 차갑게 유지하기 위해 | ||
| 100mm 페트리 접시 | 뇌 조직의 다지기를 위해 | ||
| 조직 배양 세포 스크레이퍼 | VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국 | 89260-222 | 원심분리 후 상층액을 제거하기 위해 |
| 화학 물질 | |||
| BSA 분수 V, A-9647 | Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국 | A9647-500G | 전날 Ca2+ 및 Mg2+가 함유된 DPBS에서 준비하십시오. 준비하는 동안 거품을 피하십시오. 냉장고에 보관하십시오. 사용하기 전에 10분 동안 천천히 저어줍니다. |
| Dpbs with Ca2+ & Mg2+ | 하이클론 | SH30264.FS | DPBS - 격리 버퍼의 일부 |
| 피콜 PM400 | Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국 | F4375 | 여기서 정확한 측정이 중요합니다. 젓는 막대가 있는 병에 넣어 무게를 잰다. DPBS를 첨가한 후 세게 흔듭니다. 냉장고에 보관하십시오. 아침에는 맑을 것입니다. 사용하기 전에 10-15분 동안 부드럽게 저어주십시오. 사용할 때까지 얼음에 넣어 보관하십시오. |
| 포도당(D-(+) 포도당) | Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국 | G7528 (영문 | 포도당 (D-(+) 포도당) 농도 : 5 mM |
| 수산화나트륨 표준 용액 | Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국 | 71474 | DPBS의 pH를 조정하려면 |
| 나트륨 피루브산 | Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국 | P2256 | 농도 : 1mM |
