인간 뇌에서 대뇌 모세혈관 분리: 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관을 추출하는 최적화된 방법

Abstract

출처: Hartz, A. M. S. et al. 신선한 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관 분리. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 새로운 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 분리된 모세혈관을 사용하여 체외 혈액 뇌 장벽 모델을 생성할 수 있습니다.

Protocol

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 뇌 샘플 준비

참고: 그림 1A는 아래에 설명된 전체 격리 절차의 워크플로우 차트를 보여줍니다. 인간의 뇌 조직은 피질의 어느 부분에서나 유래할 수 있으며 신선하거나 냉동된 상태로 사용할 수 있습니다. 얼어붙은 뇌 조직은 실온에서 해동할 수 있습니다(완충액 없음, 10g의 경우 ~30분). 비교 가능한 결과를 얻으려면 각 실험에 대해 동일한 뇌 영역에서 뇌 조직을 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 동결되지 않은 신선한(사후 간격 또는 PMI<4시간) 인간 대뇌 피질에 최적화되어 있습니다.

1. 인간 뇌 조직의 준비: 뇌 조직의 무게를 문서화합니다. 다음 프로토콜의 모든 숫자는 신선한 인간 뇌 조직 10g에 적합합니다. 뇌 조직을 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 집게로 모든 수막을 조심스럽게 제거하십시오. 메스를 사용하여 백질을 잘라냅니다.
2. 인간 뇌 조직 다지기: 뇌 조직을 조심스럽게 잘라 메스로 다집니다. 약 5분(2-3mm 조각) 동안 다집니다. 뇌 조직을 Potter-Elvehjem 조직 분쇄기로 옮깁니다. 30mL의 분리 버퍼를 추가합니다.
   메모: 다진 조직 조각은 다진 과정을 통해 뇌 조직이 뭉개지기 때문에 보기 어렵습니다.

2. 균질화

1. Potter-Elvehjem 조직 분쇄기(간격: 150–230 μm): 50rpm의 균질화 속도에서 100번의 스트로크로 각 샘플을 균질화합니다. 25스트로크마다 경과한 시간과 100회 스트로크에 필요한 총 시간을 문서화합니다. 제안된 균질화 프로토콜에 대해서는 표 1을 참조하십시오. 인간 전두엽 피질 10g을 균질화하는 데 걸리는 총 시간은 약 22분입니다. 거품을 방지하기 위해 공기 중에서 저어주지 마십시오.
2. Dounce 균질화기(간격: 80–130μm): 균질화를 얼음 위의 Dounce 균질기로 옮깁니다. 서스펜션을 20스트로크(~6초/스트로크, 총 ~2분)로 균질화합니다. 거품을 피하십시오.

3. 원심분리

1. 뇌 균질액을 4개의 50mL 원심분리 튜브에 균등하게 분배하고 균질액의 총 부피를 문서화합니다. 50mL의 밀도 구배 완충액을 원심분리 튜브에 분배합니다(튜브당 12.5mL). 10mL의 분리 버퍼를 사용하여 유봉과 균질기를 헹구고 4개의 원심분리 튜브(튜브당 ~2.5mL)에 분배합니다.
2. 캡으로 원심분리기 튜브를 단단히 닫습니다.균질화, 밀도 구배 매체 및 튜브를 세게 흔들어 버퍼를 혼합합니다. 5,800 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기(고정각 로터); 중간 감속 속도를 선택하여 펠릿이 튜브에 부착된 상태를 유지합니다. 상등액을 버리고 각 펠렛을 1% BSA 2mL에 재현탁합니다.

4. 여과

참고: 적혈구 및 기타 세포 파편에서 모세혈관을 분리하려면 몇 가지 여과 단계가 필요합니다.

1. 300μm 메쉬: 펠릿을 재현탁한 후 300μm 메쉬를 통해 현탁액을 필터링합니다. 모세혈관은 그물망을 통해 걸러지는 반면, 더 큰 혈관과 더 큰 뇌 파편은 그물망에 남아 있습니다. 최대 50mL의 1% BSA로 메쉬를 조심스럽게 세척합니다. 메시를 버립니다.
   메모: 이 여과 단계는 더 큰 혈관이나 뇌 파편 덩어리에서 모세관 현탁액을 제거합니다.
2. 30μM 셀 변형 필터
   메모: 이 여과 단계는 모세혈관을 적혈구 및 기타 뇌 파편에서 분리합니다.
   1. 4.1단계의 모세관 여과액을 5개의 30μm 세포 변형 필터(세포 변형 필터당 약 10mL의 모세관 여과액)에 분배합니다. 모세혈관은 이 필터에 의해 억제되는 반면, 적혈구, 다른 단세포 및 작은 뇌 파편은 필터를 통과하여 여과액에 수집됩니다.
   2. 각 필터를 1% BSA 25mL로 세척합니다. 그런 다음 모든 여과액을 여섯 번째 필터에 부어 수율을 높입니다. 각 필터를 50mL의 1% BSA로 세척합니다. 모세혈관을 포함하는 세포 균주 필터를 유지하고 여과액을 폐기하십시오.

5. 모세관 수집

1. 필터를 거꾸로 뒤집어 각 필터에 대해 50mL의 1% BSA로 모세관을 50mL 튜브로 세척합니다. 5mL 피펫터의 피펫 끝으로 부드럽게 압력을 가하고 필터를 가로질러 이동하여 뇌 모세혈관을 씻어냅니다.
2. 특히 필터 가장자리에서 모든 뇌 모세혈관을 씻어내십시오. 기포는 여과 과정을 더 어렵게 만들고 모세관 손실 가능성을 높이므로 피하십시오.

6. 세탁

1. 모세관을 채취한 후 1,500 x g의 모든 샘플을 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다(스윙 버킷 로터). 상층액을 제거하고 약 3mL의 분리 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 15mL 코니컬 튜브에 하나의 샘플에서 재현탁된 모든 펠릿을 결합하고 분리 버퍼로 채웁니다. 다시 1,500 x g에서 4°C에서 3분 동안 원심분리기를 하고 두 번 더 세척합니다.
2. 현미경(100X 배율)과 카메라(그림 1B)로 모세관 순도를 문서화합니다.
   메모: 인간 뇌 조직 10g의 뇌 모세혈관 수율은 일반적으로 약 100mg입니다. 분리된 뇌 모세혈관은 이제 실험, 처리(예: 용해물, 멤브레인 분리)에 사용하거나 급속 동결 및 냉동 튜브에서 -80°C에서 최소 6-12개월 동안 보관할 수 있습니다(여러 번의 동결-해동 주기 방지).

년 년 분

스트로크	시간
1–25	7–7.5
26–50	5–5.5
51–75	5–5.5
76–100	5–5.5
총 시간:	22–24

표 1: 균질화 프로토콜. Potter-Elvehjem 조직 분쇄기가 50rpm의 균질화 속도로 10g의 인간 전두엽 피질을 균질화하기 위한 균질화 프로토콜입니다. 처음 몇 번의 스트로크는 다진 조직을 균질화하는 데 추가 시간이 필요합니다. 이 초기 균질화 후 각 스트로크의 지속 시간은 12초입니다(하향 이동의 경우 6초, 상향 이동의 경우 6초). 따라서 초기 균질화 후 1분에 5스트로크 또는 5분에 25스트로크를 수행할 수 있습니다.

Results

그림 1: 모세관 분리를 위한 순서도. (A) 픽토그램은 신선한 인간 조직에서 뇌 모세혈관을 분리하는 절차의 주요 단계를 보여줍니다. (B) 사진은 분리 직후 광학 현미경으로 분리된 인간 뇌 모세혈관을 보여줍니다(100X 배율).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
개인 보호 장비(PPE)
Diamond Grip Plus 라텍스 장갑, Microflex 미디엄	VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국	32916-636	보호구
일회용 보호 랩코트	VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국	470146-214	PPE; 인체 원료의 특성으로 인해 일회용 실험실 코트를 사용하는 것이 좋습니다
페이스 쉴드, 사용 후 버릴 수 있습니다	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	19460102	PPE; 인체 원료의 특성으로 인해 일회용 안면 보호대의 사용이 권장됩니다
안전 재료
Clavies 고온 오토클레이브 백 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	01-815-6
Versi 드라이 벤치 용지 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	14-206-32	작업 영역을 커버하기 위해
VWR 샤프 컨테이너 시스템	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	75800-272	중고 메스의 경우
표백제 8.2% Clorox 살균 64 oz.	영국 공급 센터, 렉싱턴, 켄터키, 미국	323775
장비
4 °C 냉장고	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	Tel.: 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH 측정기	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	AB15
하이돌프 RZR 2102 컨트롤	Heidolph, 엘크 그로브 빌리지, 일리노이, 미국	501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR 원심분리기	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	75004521
Leica L2 해부 현미경	Leica Microsystems Inc, 미국 일리노이주 버팔로 그로브		수막을 제거하는 데 사용됩니다.
POLYTRON PT2500 균질화기	Kinematica AG, 스위스 루체른	9158168
P-403 스케일	Denver Instrument, 보헤미아, 뉴욕, 미국	191392
표준 미니 교반	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	1151050
Thermo-Flasks 액체 질소 듀어	Thermal Scientific, Mansfiled, 텍사스, 미국	11-670-4씨	조직을 동결하는 데 사용됩니다.
Voyager Pro 분석 저울	오하우스, 파시파니, 뉴저지, 미국	VP214CN
ZEISS 액시오베르트 마이크로코프	Carl Zeiss, Inc Thornwood, 뉴욕, 미국		분리된 모세관을 확인하는 데 사용됩니다.
도구 및 유리 제품
Finnpipette II 피펫 1-5 mL	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	21377823T1	필터에서 모세혈관 세척
Finnpipette II 피펫 100-1,000 μL	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	21377821T1	BSA에서 펠릿 재현탁
피펫 보이	Integra, Hudson, NH, 미국	739658
50 mL Falcon 튜브 25/랙 - 500/cs	VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국	21008-951
EISCO 메스 블레이드	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	S95938C	뇌 조직을 다지기 위해
파라필름	VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국	52858-000	비커와 부피 플라스크를 덮기 위해
Thermo Scientific 핀팁 피펫 팁 5 mL	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	Tel.: 21-377-304	필터에서 모세혈관을 씻어내려면
60 mL 주사기(Luer-Lok 포함	Thermo Fisher Scientific, 미국 펜실베니아 주 피츠버그	BD309653	모세관을 여과하기 위해 커넥터 링과 함께 사용
메스 손잡이 #4	Fine Science Tools, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국	10060-13	다지기에 사용
Dumont 집게 #5	Fine Science Tools, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국	11251-10	수막을 제거하는 데 사용됩니다.
Potter-Elvehjem 티슈 그라인더	Thomas Scientific, 미국 뉴저지주 스웨덴보로	3.43E+28	50 mL 용량, 간격: 150-230 μm
Dounce 균질화기	VWR, 래드너 펜실베니아 미국	62400-642	15 mL 용량, 간격: 80-130 μm
스펙트럼/메쉬 우븐 필터(300μm)	Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, 캘리포니아, 미국	146424	남아 있을 수 있는 수막을 제거하기 위해 모세관 현탁액을 여과하는 데 사용됩니다
pluriStrainers (기공 크기 : 30 μm)	pluriSelect Life Science, 라이프치히, 독일	Tel.: 43-50030-03
커넥터 링	pluriSelect Life Science, 라이프치히, 독일	41-50000-03	여러 번 재사용
1 L 용량 측정 플라스크			절연 버퍼 준비용
1L 비커			1% BSA 제조용
교반 바			1% BSA 및 Ficoll® 제조용
Schott 병 (60mL)			Ficoll®의 준비를 위해
얼음 양동이			모든 것을 차갑게 유지하기 위해
100mm 페트리 접시			뇌 조직의 다지기를 위해
조직 배양 세포 스크레이퍼	VWR, 래드너, 펜실베니아, 미국	89260-222	원심분리 후 상층액을 제거하기 위해
화학 물질
BSA 분수 V, A-9647	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	A9647-500G	전날 Ca2+ 및 Mg2+가 함유된 DPBS에서 준비하십시오. 준비하는 동안 거품을 피하십시오. 냉장고에 보관하십시오. 사용하기 전에 10분 동안 천천히 저어줍니다.
Dpbs with Ca2+ & Mg2+	하이클론	SH30264.FS	DPBS - 격리 버퍼의 일부
피콜 PM400	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	F4375	여기서 정확한 측정이 중요합니다. 젓는 막대가 있는 병에 넣어 무게를 잰다. DPBS를 첨가한 후 세게 흔듭니다. 냉장고에 보관하십시오. 아침에는 맑을 것입니다. 사용하기 전에 10-15분 동안 부드럽게 저어주십시오. 사용할 때까지 얼음에 넣어 보관하십시오.
포도당(D-(+) 포도당)	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	G7528 (영문	포도당 (D-(+) 포도당) 농도 : 5 mM
수산화나트륨 표준 용액	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	71474	DPBS의 pH를 조정하려면
나트륨 피루브산	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	P2256	농도 : 1mM