형광 펩타이드 자이모그래피: 자이모그램 겔에서 형광 기질을 사용하여 프로테아제 활성을 검출하는 수정된 기술

초록

출처: Deshmukh, A. A. et al. 형광 펩타이드 자이모그래피에 의한 프로테아제 활성 검출. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 생물학적 샘플 내의 단백질 분해 활성을 분석하기 위해 전기영동 기술인 자이모그래피를 수행합니다.

프로토콜

1. 펩타이드 자이모그래피 겔에서 생물학적 샘플의 전기영동

1. 기존 zymography 샘플 버퍼 (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25 % glycerol, 4 % SDS, 0.01 % bromophenol blue)에서 샘플을 용해시킵니다. 세포 및 조직 샘플의 경우 웰당 총 단백질 ~30 μg이 권장되며, MMP 표준물질의 경우 50–100 ng의 단백질이 권장됩니다.
2. 겔 장치에 400mL의 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer를 추가합니다. 웰당 최대 35μL의 시료를 로드합니다. 120V, 4°C에서 1.5시간 동안 또는 분자량 표준물질에서 관심 프로테아제가 펩타이드 분해 겔 층(주황색이 보임) 내에 있음을 나타낼 때까지 샘플을 실행합니다.
   메모: 대부분의 MMP와 그 변형은 35–100kDa의 범위에 속합니다. 분자량 표준물질이 이러한 중량이 펩타이드 분해 겔 층 내에 있음을 나타내면 전기영동을 중지할 수 있습니다. 동일한 원리가 알려진 분자량을 가진 다른 종류의 프로테아제에도 적용될 수 있습니다. 더 넓은 범위의 분자량에서 여러 프로테아제를 검출하는 데 관심이 있는 경우, 분해 겔 층의 크기를 줄이고 펩타이드 분해 겔 층의 크기를 늘리십시오.
3. 전기 영동 후, 플라스틱 카세트에서 젤을 제거하고 50 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 2.5 % Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ 및 5 mM CaCl₂를 포함하는 renaturing buffer에서 부드러운 교반으로 실온에서 각각 10 분 동안 젤을 세 번 세척합니다.
4. 50 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 1 % Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ 및 5 mM CaCl₂를 포함하는 개발 완충 용액으로 겔을 15 분 동안 전달합니다. 새로운 개발 완충 용액으로 교체하고 37 ° C에서 24 시간 동안 부드러운 교반으로 겔을 배양하여 겔이 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오.
5. 24시간 후, 적절한 excitation 및 emission filter를 사용하여 형광 젤 스캐너/이미저를 사용하여 이미지를 겔화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5mm 빈 젤 카세트	써모피셔 사이언티픽	엔씨2015
20% SDS 솔루션	앰비언	AM9820
3x 자이모그래피 샘플 버퍼	바이오 라드	1610764
Azido-PEG3-Maleimide 키트	화학 도구를 클릭합니다	AZ107
PowerPac 기본 전원 공급 장치	바이오 라드	1645050
프리시전 플러스 프로틴 듀얼 컬러 스탠다	바이오 라드	Tel.: 161-0374
PrecisionGlide 피하 주사 바늘	피셔 사이언티픽	제14-826