자궁 전기천공법 기반 유전자 전달: 쥐 배아의 배아 소뇌 세포에 플라스미드 DNA를 주입하는 기술

초록

출처: Feng W. et al. 자궁 내 전기천공법 기반 유전자 전달을 사용한 소뇌 과립 세포의 CRISPR 매개 기능 손실 분석. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 자궁 내 전기천공법을 사용하여 쥐 배아의 소뇌 신경 세포에 플라스미드 DNA를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 정상적인 뇌 발달에서 유전자의 생체 내 기능과 종양 진행 중 뉴런 세포의 유전자 발현 변화를 이해하는 데 유용합니다.

프로토콜

1. 자궁 Electroporation에서 실행하십시오

1. 6주에서 8주 된 생쥐를 사육하고 자궁 내 전기천공술을 위한 도구를 준비합니다. 수컷 동형접합 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 마우스와 암컷 CD-1 마우스를 교차시킵니다. 질 마개가 감지된 날로부터 CD-1 마우스의 임신 시간을 측정합니다(E0.5). 배아는 E13.5일에 전기천공됩니다.
   1. 마이크로피펫 풀러로 붕규산 유리 모세관(내경: 0.6–0.8mm)을 당깁니다. P = 500, Heat = 560, Pull = 150, Vel = 75, Time = 250 설정을 사용합니다. 주입 중 더 나은 시각화를 위해 모세관 끝에 검은색 잉크로 라벨을 붙입니다. 자와 날카로운 바늘 핀셋을 사용하여 실체 현미경 아래에서 모세관 테이퍼를 자르고 팁을 약 6mm 길이로 다듬습니다.
   2. 실험의 재현성을 유지하기 위해 모세혈관의 단일성을 유지합니다. 트리밍하는 동안 한면 베벨 가장자리를 만듭니다. 끝은 자궁벽을 쉽게 관통하고 배아의 조직 손상을 방지하기 위해 가능한 한 날카로워야 합니다.
      메모: 또는 마이크로 그라인더를 사용하여 35° 각도를 조정합니다. 모세혈관은 병원균이 없는 조건에서 10cm 페트리 접시에 실온으로 보관할 수 있습니다.
   3. 수술 기구를 오토클레이브합니다.
   4. sgRNA-plasmids를 pT2K-IRES-Luc와 동일한 비율로 각 plasmid에 대해 최소 1 μg/μL의 최종 농도로 혼합하고 plasmid 용액을 빠른 녹색(최종 농도 0.05%)으로 착색합니다. 내독소가 없는 증류수로 1% 고속 녹색 원료 용액을 준비하고 0.22μm 필터를 통해 여과하여 용액에서 염료 입자를 제거합니다.
      메모: pT2K IRES-Luc의 동시 transfection은 선택 사항이지만, 생물 발광 이미징을 사용하여 출생 후 생존 가능한 전기천공 동물을 식별할 수 있습니다. 수술할 총 임신 마우스 수에 충분한 양의 플라스미드 혼합물을 준비합니다. 마우스당 약 15–20 μL 혼합물(~12 배아)을 사용합니다. 즉시 수술을 진행하십시오.
2. 수술을 위한 마우스 준비
   1. 임신한 CD-1 마우스를 이소플루란으로 마취합니다. 3-4 vol-% 이소플루란(산소 유량: 1.5 L/min)으로 상자에 마취를 유도하고 노즈 콘을 통해 수술 중 2 vol-%로 유지합니다.
      메모: 전체 수술은 30분 이상 소요되어서는 안 됩니다. 필요한 경우 주입 및 전기 천공된 배아의 수를 줄입니다.수술 시 멸균 장갑을 사용합니다.
   2. 마우스를 가열 패드에 등을 대고 놓고 마취를 조정합니다.
   3. 진통제 주사 (메타 미졸, 체중 800 mg/kg, 피하 (s.c.), 24 h depot).
      메모: Metamizol 이외의 다른 승인된 진통제를 사용할 수 있습니다.
   4. 수술 중 안구 건조를 방지하기 위해 안연고를 바르십시오.
   5. 테이프로 팔다리를 고정하고 소독제로 복부를 소독합니다. 거즈로 마우스를 덮고 수술 부위만 노출시킵니다. 수술 부위와 거즈에 70% 에탄올을 펴 바릅니다.
   6. 약 2cm 길이의 피부 절개를 하고 스트레이트 수술 가위로 틈새를 부드럽게 넓힙니다. linea alba를 찾아 끝이 뭉툭한 조직 가위를 사용하여 복막을 통해 약간 더 작은 두 번째 절개를 만듭니다.
   7. 예열된 멸균 1x PBS로 열린 복강을 적십니다.
   8. 고리 집게를 사용하여 복강에서 자궁 뿔을 조심스럽게 추출합니다. 인접한 두 배아의 난황낭 사이의 틈에서만 자궁 벽을 잡고 부드럽게 당깁니다. 절개 부위를 통해 배아를 당기는 동안 배아에 가해지는 압력을 피하십시오. 필요한 경우 절개 부위를 확대하고 자궁 동맥을 통한 혈류를 압박하지 않으면서 자궁 뿔을 복부에 위치시키는 데 각별히 주의하십시오.
      메모: 어떤 경우에는 한 번에 하나의 자궁 뿔을 추출하고 두 번째 자궁 뿔을 진행하기 전에 교체하는 것이 좋습니다.
3. 플라스미드 DNA의 주입 및 전기천공법
   1. 준비된 유리 모세관으로 약 15μL의 유색 플라스미드 용액을 흡입합니다. 이 과정에서 기포를 피하십시오.
      메모: 플라스미드 용액은 농도가 높으면 팁을 쉽게 막을 수 있습니다. 주사 직전에 일부 DNA를 방출하여 모세혈관을 테스트합니다.
   2. 링 집게로 배아를 부드럽게 잡고 목 부위를 찾습니다.
      메모: 배아가 주입하기 어려운 위치에 있으면 건너뛰고 다음 배아로 이동합니다. 배아의 재배치가 증가하면 배아가 손상될 가능성이 높아질 수 있습니다.
   3. 미리 준비된 유리 모세혈관의 끝으로 등쪽 뒷뇌를 관통하여 제4심실로 천천히 뚫고 약 1μL의 플라스미드 혼합물을 주입합니다. 염색된 DNA가 뇌에서 누출되지 않고 다이아몬드 모양의 구조로 보이는지 확인합니다.
      메모: 선택 사항으로, 2.5배 돋보기를 사용하여 제4심실과 주변 혈관을 더 잘 볼 수 있습니다. 주입 직후 전기 펄스를 전달하여 플라스미드 용액이 다른 심실로 확산되는 것을 방지합니다.
   4. 집게와 같은 백금 핀셋으로 전기 사각 펄스(5 pulses, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off)를 적용합니다(재료 표 참조). 음극이 귀를 덮고 양극이 자궁벽 위의 소뇌 원두에 위치하도록 전극을 측면으로 배치합니다. E13.5 embryos.
      의 효과적인 전기천공을 위해 5mm 직경의 전극판을 사용합니다. 메모: 댐당 총 배아 수의 2/3 미만을 조작하여 새끼의 생존율을 높입니다. 자궁경부에 너무 가까운 배아를 피하십시오. 조작하면 분만 중 합병증을 일으키고 전체 새끼를 위태롭게 할 수 있습니다. 전극이 배아의 심장에 너무 가까이 있으면 심장 마비가 발생할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
오토클레이브 밴드	키스커 바이오텍	150262
일렉트로 스퀘어 포레이터	증권 시세	ECM830
Endofree 맥시 키트	키아겐	12362
에탄올	머 크	107017
눈 연고(Bepanthen)	바이엘	81552983
패스트 그린	머 크	104022
필터(0.22μm)	머 크	F8148
집게 스트레이트	정밀 과학 도구	91150-20
거 즈 (X100 ES 패드 8f 10 × 10cm)	피셔 사이언티픽	15387311
필라멘트가 있는 유리 모세관	나리시게	GD1-2
히팅 패드	써모럭스	463265 / -67
이소플루란	조에티스	TU061219
링 집게	정밀 과학 도구	11103-09
실체현미경	니콘	C-추신
수술용 가위	정밀 과학 도구	91460-11
끝이 뭉툭한 수술용 가위	정밀 과학 도구	14072-10
핀셋(5mm 디스크 전극 포함) 플래티넘	엑셀티스 GmbH	CUY650P5
메타미졸	증권 시세
비멸균 실크 봉합사(0.12mm)	정밀 과학 도구	18020-50
PBS(1배)	생명 기술	14190169
티슈 가위 뭉툭한 (11.5 cm)	정밀 과학 도구	14072-10
pCAG-EGxxFP	애드진	50716
pX330 플라스미드	애드진	42230

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