쥐 신경주위 침입 모델: 마우스 좌골 신경에서 신경주위 침입을 시뮬레이션하기 위한 생체 내 모델 생성

초록

출처: Deborde, S. et al. 신경 주위 침습의 생체 내 쥐 좌골 신경 모델. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 췌장암 세포를 좌골 신경에 주입하여 신경주위 침습을 위한 생체 내 마우스 모델을 개발합니다. 이 모델은 침입 정도를 정량화하고 암세포와 신경 간의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 생쥐 준비 및 수술

참고: 이 연구에는 8주 된 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스가 사용됩니다. 수술 조건은 우리 기관의 IACUC 규칙을 따릅니다. 기구는 멸균되고, 수술 작업 표면은 소독되며, 동물은 소독되고, 외과의는 멸균 장갑을 착용합니다.

1. 수술 전날, 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취한 다음 얇은 면도기 또는 화학 제모제로 등쪽 대퇴골 길이를 따라 털을 제거합니다.
2. 수술 당일, 유도 챔버에서 2% 이소플루오란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집음 자극과 반응 부족으로 마취를 확인합니다.
3. 마취 시 건조함을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
4. 마취된 마우스를 복부 쪽에 놓고 저자극성 테이프로 각 팔다리를 부드럽게 고정하여 주입할 사지에 가벼운 장력을 만듭니다.마취는 정밀 기화기와 노즈콘을 통해 전달되는 이소플루란을 사용하여 유지됩니다.
5. 베타딘으로 주사 부위를 청소한 다음 다시 70% 알코올로 청소합니다. 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 수술 부위에 느슨한 머리카락이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
6. 대퇴골과 평행하게 약 2mm 아래에 있는 작은 가위로 1cm를 절개합니다. 집게로 피부를 옆으로 수축시켜 아래 근육을 노출시킵니다.
7. 좌골 신경은 대둔근(gluteus maximus)과 대퇴 이두근(biceps femoris muscle)으로 깊숙이 연결되어 있습니다. 작은 가위로 근막면을 따라 이 두 근육을 분리하고 아래에 있는 좌골 신경을 노출시킵니다. 둔기 박리를 사용하여 주변 근육에서 신경을 해방시킵니다.
8. 펠릿에서 3μL의 암세포(약 50,000개 세포)를 10μL 주사기로 추출합니다.
   메모: 또는 3μL의 PBS를 대조군으로 추출합니다.
9. 주사 지점의 신경 아래에 작은 금속 주걱을 놓아 지지합니다. 해부 현미경을 사용한 시각화 하에서 바늘을 금속 베이스에 대한 신경에 삽입하고 삽입 시 바늘을 신경과 가능한 한 평행하게 유지합니다. 신경 뒤쪽에 구멍을 뚫지 않도록 주의합니다. 이 과정에서 신경의 취급을 최대한 최소화하십시오.
10. 5초에 걸쳐 천천히 신경에 주입합니다. 주입 부위에 전구가 형성되면 주입이 양호하다는 것을 나타냅니다. 그런 다음 바늘을 부드럽게 제거하기 전에 바늘을 3초 동안 제자리에 두십시오. 바늘을 3초 동안 제자리에 유지하면 세포가 신경 밖으로 역류하는 것을 최소화할 수 있습니다.
    메모: 주사는 원위 신경 또는 척수를 향해 수행할 수 있습니다. 일련의 실험 내에서 일관성을 유지하는 것이 중요합니다. 세포가 외부로 유출되면 동물은 실험 분석에 포함되어서는 안됩니다. 경험에 비추어 볼 때 이러한 이벤트는 매우 드뭅니다.
11. 신경을 원래 위치로 되돌립니다. 위에 있는 근육으로 신경을 덮으십시오. 적절한 진통제로 쥐를 치료한 다음 5-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다.
12. 마취에서 완전히 깨어날 때까지 회복하는 동안 관찰을 위해 쥐를 깨끗한 케이지에 혼자 두십시오.
    메모: 동물이 완전한 의식을 회복하는 데 5-15분 정도 걸립니다. 동물은 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 방치되지 않습니다. 동물은 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지지 않습니다. 그 후, 72시간 동안 24시간마다 한 번 이상 회복을 평가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마우스			실험 요구에 따른 수와 연령 변수
전기 면도기	왈	9962	상업용 제모제로 대체할 수 있습니다.
이소플루란, 250 mL	백스터	1001936060
저자극성 수술용 테이프	3M 블렌더	70200419342
베타딘 스왑스틱	PDI	참조 : 41350
Webcol 알코올 준비	코비디엔	5110
멸균 수술 도구(가위 및 집게)
10 μL Hamilton 주사기	해밀턴	80308
스틸 마이크로 주걱	피셔 사이언티픽	S50823
해부 현미경
부피바신, 1g	엔조 생명과학	BML-NA139-0001	0.5%로 재구성
5-0 나일론 봉합사	에티콘	698시간

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