$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 좌골 신경 추출
- 이전에 좌골 신경에 암세포를 주입한 쥐를 CO2로 안락사시킵니다. 마우스를 복부 쪽에 놓고 핀을 사용하여 말단발을 안정시킵니다.
- 주입한 팔다리와 몸통의 등쪽 피부를 제거합니다.
- 둔기 박리를 사용하여 좌골 신경을 근육 깊숙이 노출시킵니다.
- 신경은 장골과 천골 사이를 오갑니다. 척수 부위의 신경에 접근하려면 두 개의 뼈를 분리해야 합니다. 먼저 좌골 신경이 위치한 좁은 부분에 닫힌 가위를 삽입한 다음 마우스를 잡고 가위를 엽니다. 섬세하고 절개 중 좌골 신경의 무결성을 유지하십시오.
- 좌골 신경을 대퇴골 말단부와 척수 근위부에서 조심스럽게 절개합니다.
메모: 침범된 신경은 극도로 약하며 긴장이나 강압적인 취급에 의해 부서지기 쉽습니다.
- 먼저 말단부를 잘라 신경을 적출합니다. 신경을 조심스럽게 들어 올리면서 인접한 조직에서 신경을 분리하십시오. 근위부 끝의 신경을 척추에서 나오는 신경에 최대한 가깝게 절단합니다.
- 그런 다음 Vernier caliper를 사용하여 총 침입 길이를 기록합니다. 이 거시적 추정치는 참고용일 뿐입니다.
2. 신경 처리 및 정량화
- 절개된 신경을 OCT 화합물에 삽입한다. 신경을 세로로 그리고 가능한 한 곰팡이 바닥에 평평하게 놓으십시오.
- 카세트에 문자 P(근위부)와 D(원위부)를 표시하여 신경의 근위부와 원위부를 표시합니다.
- 드라이아이스 위에 박혀 있는 신경을 즉시 절제하지 않는 경우 위에 놓습니다. 샘플은 -80 °C에서 몇 주 동안 보존 할 수 있습니다.
- 5μm 두께의 저온 유지 장치 마이크로톰을 사용하여 샘플을 절단하고 유리 슬라이드에 절편을 배치합니다. 가능하면 슬라이드당 두 개의 신경 섹션을 맞춥니다. 신경의 근위부를 나타냅니다.
- H&E 염색을 사용하여 미끄러지는 염색
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- 고해상도 디지털 데이터를 제공하는 슬라이드 스캐너로 염색된 신경 부분을 디지털 방식으로 스캔합니다.
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 측정 거리 버튼, 침입 영역 또는 기타 원하는 매개변수를 클릭하여 침입 길이를 정량화합니다. 침습 기간을 잘 추정하려면 동일한 신경의 여러 섹션(2-4)을 사용하십시오.