종양 세포를 제브라피시 배아로 장기 정소성 이식: 종양 세포 거동의 장기 분석을 위해 종양 세포를 제브라피시 배아의 제4심실로 전달하는 효율적인 방법

초록

출처: Casey, M. J. et al. 종양 세포 행동 및 약물 반응의 장기 연구를 위해 제브라피시 소아 뇌종양을 면역 능력 숙주에 이식.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 제브라피시 뇌종양 세포를 면역 능력이 있는 제브라피시 배아의 제4심실로 이식하는 정소성 이식을 보여줍니다. 이 절차를 통해 종양 세포 침입 및 행동에 대한 장기적인 연구를 수행할

수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 2-dpf 배아의 네 번째 심실에 종양 현탁액 주입

1. 전달 피펫을 사용하여 10-20개의 마취된 탈부착 배아를 주입판 주변부로 이식합니다. 배아는 주입판에 측면으로 떨어져야 하며, 심실이 명확하게 보이고 접근할 수 있어야 합니다. 각진 프로브를 사용하여 필요에 따라 배아를 조정하고 주입 플레이트의 바깥쪽 가장자리에서 멀리 떨어진 곳에 배치합니다.
2. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 1–2 μL의 종양 세포 현탁액을 주입 바늘에 로드하고 바늘을 매니퓰레이터에 삽입합니다.
3. 바늘을 45° 각도로 잡고 매니퓰레이터를 수동으로 내립니다. 바늘이 배아 머리 바로 위와 오른쪽으로 약 5mm 지점까지 micromanipulator의 손잡이를 x, y, z 방향으로 조정합니다. 실체현미경의 접안렌즈를 통해 바늘이 배아의 제4심실을 관통할 때까지 x 방향으로 미세 조작기를 천천히 조정합니다. 바늘이 심장이나 노른자를 뚫지 않도록 하십시오.
   1. 마이크로인젝터에 부착된 풋 페달을 밀어 종양 세포 현탁액을 주입합니다.
      메모: 사출 압력과 시간은 니들 보어 크기에 따라 다르지만 5-10 PSI 및 50-100 ms로 시작하는 것이 좋습니다. 주입된 종양 세포의 부피는 원하는 경우 미네랄 오일에 주입하여 표준 오일 방울 기술로 평가할 수 있습니다. 일반적으로 0.1mm의 방울 직경으로 500pL를 주입하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.
4. 주입된 배아를 주입판에서 부드럽게 헹구고 신선한 달걀수(역삼투압 물에 수족관 소금 0.6g/L + 메틸렌 블루 0.01mg/L)를 사용하여 페트리 접시에 넣습니다. 나머지 절차를 위해 또는 탱크에서 자랄 때까지 배아를 난수에 보관하십시오.
5. 형광 실체현미경으로 주입된 배아를 검사합니다. 주입 압력, 각도, 바늘 크기 및 세포 현탁 점도로 인해 종양 세포가 심실 공간의 25–50%를 채우는지 확인합니다. 필요에 따라 이러한 매개변수를 조정합니다.
6. 남아 있는 배아에 대해 1.1–1.5단계를 반복합니다. 필요에 따라 추가 배아를 마취합니다.
   메모: 숙련된 사용자는 3-4시간 동안 최대 300개의 배아를 주입할 수 있습니다.
7. 배아를 28°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 다시 넣습니다.
8. 다음 날, 설명된 대로 정상적인 심장 및 뇌 발달과 같은 형태학적 및 생리학적 특징을 검사하여 배아 생존을 평가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
달걀 물	사내에서		배아 유지, 주입판 만들기
페트리 접시	써모 피셔	FB0875711Z	배아 수용, 주입 플레이트 만들기
유리 용기	모든 상업 브랜드		사출 플레이트 만들기
마이크로피펫	모든 상업 브랜드		종양 재현탁액 및 이식
각진 프로브	정밀 과학 도구	10140-02	배아 조작
이송 피펫	모든 상업 브랜드		배아 조작
실체현미경	올림푸스	SZ61	종양 이식
형광 실체현미경	올림푸스	사이즈16	영상 종양 이식
현미경 카메라	올림푸스	DP-72	영상 종양 이식
부 화기	모든 상업 브랜드		배아 유지, 주입판 예열
엔2	모든 상업 브랜드		마이크로인젝터 설정용
유리 모세관(필라멘트 없음)	세계적인 정밀 기기	TW120-4	종양 이식
니들 풀러	셔터 기기	P-97	종양 이식
마이크로로더 팁	에펜도르프	930001007	종양 이식
마이크로인젝터	하버드 기구	플리-90	종양 이식
트리카인-S (MS-222)	웨스턴 케미칼	TRS1	종양이식, 마취제
아가로스	덴빌	CA3510-8	사출 플레이트 만들기
마이크로파	모든 상업 브랜드		사출 플레이트 만들기
저울	모든 상업 브랜드		사출 플레이트 만들기
장갑	모든 상업 브랜드		프로토콜의 모든 측면
프로나제	로슈진단	11459643001	탈염 배아
면도날	써모 피셔	12640	바늘 준비
50mL 비커(직경 2인치)	모든 상업 브랜드		사출 플레이트 만들기
유리 용기	모든 상업 브랜드		사출 플레이트 만들기
메틸렌 블루	시그마-알드리치	M9140	곰팡이 성장을 방지하기 위해 달걀 물에 첨가

년 년 하십시오.