쥐 모델에서 치료용 신경 줄기세포(NSC)의 비강 내 전달: 종양 용해성 바이러스가 로드된 NSC를 뇌종양 베어링 마우스 모델에 종양 표적 전달하기 위한 절차

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 인간 NSC의 저산소 전조건화(그림 1A)

1. 90% 포화도에 도달할 때까지 T75 배양 플라스크에서 플레이트 배양된 NSC.
2. 자동 내장 유량계로 제어되는 N₂ 가스 공급을 통해 24시간 동안 1% O₂ 수준을 유지한 가습된 CO₂ 챔버/인큐베이터 내부에 세포 배양 플라스크를 놓습니다. 이러한 셀을 ^HNSC라고 합니다. 제어 ^NNSC는 다음과 같이 생성됩니다.
   1. 95% 실내 공기 및 5% CO₂ 하에서 가습된 37°C 인큐베이터에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 인간 NSC(클론 HB1.F3.CD)를 유지합니다.

2. 인간 NSC에 종양 용해성 바이러스 로딩 (그림 1B-1H)

1. ^NNSC, ^HNSC를 50개의 조건부 복제 아데노바이러스(CRAd)-S-pk7 바이러스 입자/세포로 감염시킵니다.
2. 주기적인 태핑으로 실온에서 2시간 동안 배양한 후 배지로 세포를 세 번 세척하여 결합되지 않은 바이러스 입자를 제거하고 주입을 위해 멸균 식염수에 세포를 현탁시킵니다.
   주의: BSL2와 같은 적절한 생물 안전성 수준이 지정된 시설에서 모든 바이러스 관련 체외 세포 배양 절차를 수행합니다. 기관 동물 시설 지침에 따라 종양 용해성 바이러스를 다루는 연구자는 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.

3. 치료용 NSC의 비강 내 전달(그림 1D 및 그림 2D)

1. NSC(^NNSC, ^HNSC)를 배양하고 수집합니다.
2. 절차에 따라 케타민과 자일라진 혼합물의 i.p. 주입을 통해 마우스를 마취합니다.
   1. 승인된 시약을 사용하여 체중에 따라 동물을 마취하거나, 즉, 200–250 μL 멸균 식염수에 케타민(50–100 mg/kg, 승인된 용량 범위는 기관 IACUC 문의) 및 자일라진(5-10 mg/kg, 승인된 용량 범위는 기관 IACUC 참조)의 혼합물을 복강내(IP) 주사를 통해 동물을 마취합니다. 또는 흡입 장치를 사용하여 4-5% 이소플루란 마취를 통해.
3. 체온을 유지하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 깨끗한 드레이프에 쥐를 놓습니다. 말아 올린 종이 타월로 만든 푹신한 베개를 테이프로 조정하여 마우스 머리 아래에 놓았을 때 콧구멍이 직립 각도가 되도록 합니다.
4. 마이크로피펫을 사용하여 마우스의 각 콧구멍에 2μL의 NSC 현탁액을 분배합니다. 다음 마우스로 이동하기 전에 물방울의 흡인을 육안으로 확인하십시오. 전달되는 총 셀 수는 사용자가 결정할 수 있습니다. 62,500–125,000 cells/μL를 사용하여 0.5–100만 개의 세포를 4 x 2 μL 용량으로 전달할 수 있습니다.
5. 타이머를 사용하여 각 세포 현탁액 투여 사이에 5분 간격(최대 4회)을 보장합니다.
6. 동물이 회복실에서 이동성을 회복할 수 있도록 하고 누운 자세를 전체적으로 유지합니다.

그림 1: 비강 내 분만 전에 관련된 일반적인 줄기세포 준비 절차에 대한 순서도. (가-씨) CXCR4를 과발현하기 위한 줄기세포의 저산소 전처리 또는 유전자 변형. (B–D) 세척, 효소 해리, 세포 채취 및 계수 단계는 줄기세포에 치료 또는 진단용 화물을 차후 적재하기 위해 수행됩니다. (E) 종양 용해성 바이러스와 같은 치료 시약 또는 MPIO 입자와 같은 진단 추적자를 주기적인 진탕과 부드러운 교반으로 적절한 농도로 수집된 줄기세포에 적재할 수 있습니다(F). (지–나) 그런 다음 적재된 줄기세포를 세척하고 마우스로의 비강 내 전달을 위해 계수할 수 있습니다.

그림 2: 관련된 일반적인 동물 절차의 개략적 흐름도. (A) 종양 모델은 환자 유래 신경교종 세포의 이종 이식을 통해 만들어집니다. (B) 종양 성장은 BLI를 통해 모니터링됩니다. (C) 머리만 방사선 조사 요법을 시행합니다 (D) 치료적 비강 내 줄기 세포 전달 중에 누운 자세와 머리를 기울이는 자세를 유지합니다. (E) 치료 후 생존 모니터링, 소동물 영상 촬영 및 필요한 경우 조직의 조직학적 분석을 추적합니다.