미세종양의 생성: 약물 치료에 대한 반응을 분석하기 위해 3D 미세종양을 배양하는 체외 배양 기술

초록

출처: Gilbert, A. N. et al. 키노믹 프로파일링 및 약물 반응 테스트를 위한 3D 인간 바이오겔 배양 시스템 및 환자 유래 교모세포종 세포를 사용한 미세 종양 생성. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오에서는 3D 인간 바이오겔을 사용하여 환자 유래 종양 세포에서 미세 종양을 생성합니다. 이러한 미세종양은 체내 종양 미세환경과 매우 유사하며 약물 검사를 위한 잠재적인 플랫폼 역할을 합니다.

프로토콜

1. 미세종양 발생

1. 시약의 준비
   1. 완전한 NBM을 준비하기 위해 Neurobasal Media(NBM) 500mL 병 1병에 다음을 추가하여 완전한 NBM을 준비합니다: 비타민 A가 없는 10mL B-27 보충제, 5mL N2 보충제, 100μL EGF, 100μL 섬유아세포 성장 인자(FGF)-Basic, 5mL 암포테리신 B, 0.5mL 겐타마이신, 5mL L-글루타민 및 내부 프로토콜에 따라 중화된 고밀도 인간 바이오겔(HuBiogel)(3mg/mL의 HDHG)을 준비합니다. 유사한 바이오겔 매트릭스도 사용할 수 있습니다.
2. 미세종양 생산 및 배양
   1. 얼음 위에서 완전한 NBM에서 갓 해리된 PDX 세포를 단일 세포 현탁액으로 얻습니다.
   2. 세포 현탁액을 동일한 부피의 트리판 블루 용액(PBS에서 0.4%)과 혼합하고 혈구계를 사용하여 분석하여 트리판 블루 배제에 의한 세포 수와 생존율을 측정합니다. 부피 = (50,000 세포/종양 * # 종양)/(생존 세포 수 / 1mL)인 50,000 세포/미세종양을 생성하는 데 필요한 부피를 제거하고 새로운 원뿔형 튜브에 넣습니다.
   3. 실온에서 150 x g에서 8분 동안 원심분리를 통해 세포를 농축합니다. 상등액을 버리고 FBS의 세포 1부와 HDHG의 세포 4부의 최종 비율로 얼음처럼 차가운 HDHG 용액으로 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   4. 전자 멀티채널 피펫을 사용하여 핀 셀-HDHG 혼합물당 10μL를 96핀 강판(소수성 코팅 포함)에 분주하여 미세종양(각각 50,000개의 세포를 포함하는 2mm 비드)을 생성합니다.
   5. 조직 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂, 가습) 내부에 3D 종양 비드를 15분 동안 배치하여 비드를 겔화합니다.
   6. 겔화 후 전자 다중 채널 피펫 및 맞춤형 핀 장치를 사용하여 미세종양(10μL)을 완전한 NBM이 포함된 맞춤형 현탁 배양 챔버(50mL) 또는 대용량 배양 접시(10cm)로 옮깁니다.
   7. 조직 배양 인큐베이터에서 1-2일 후 와이드 마우스 디스펜싱 피펫을 사용하여 50μL NBM/웰을 함유한 96웰 배양 플레이트로 미세종양을 옮기고 다양한 분석 및 분석 프로토콜을 수행합니다.
3. 약물 치료 및 미세종양 유지 관리
   1. 약물 검사를 위한 최종 농도를 선택합니다.
      참고: 약물이 2D 배양에서 효능이 알려진 경우 중간 용량 농도로 IC50의 2배를 선택하고 위와 아래의 3배 연속 희석을 선택하여 총 5회 용량 수준을 선택합니다. 예를 들어, 2D 배양에서 약물에 대해 IC50이 9μM인 경우 약물 검사를 위한 최종 농도로 2μM, 6μM, 18μM, 54μM 및 162μM를 선택합니다.
   2. 디메틸 설폭사이드(DMSO) 스톡에서 완전한 NBM으로 2x 약물 투여 용액을 준비합니다. 분주 용액을 1% DMSO 배지에 희석하여 5회 분량, 3배 연속 희석을 준비합니다.
   3. 분석 플레이트에 50μL가 포함된 미세종양 웰에 50μL의 투여 용액을 추가하여 0.5%의 최종 DMSO 농도를 달성합니다. 1.3.1단계에서 결정된 각 약물 용량에서 각 반복(예: 4)에 대해 반복합니다.
   4. 37°C, 5% CO₂, 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 1-14일 동안 배양을 유지합니다. 위와 같이 배지와 약물 용액을 상쾌하게 하여 일주일에 두 번 배양액을 공급합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐분해효소-I	시그마-알드리치	이산화탄소130
뉴로베이스알-A	생명 기술	제10888-022
N-2 보충제	생명 기술	제17502-048	1x 최종 농축
비타민 A가 없는 B-27 보충제	생명 기술	제12587-010	1x 최종 농축
재조합 인간 FGF-basic	생명 기술	PHG0266	10ng/mL 최종 농도
L-글루타민	코닝(주) Cellgro Mediatech	25-005-CI	2mM 최종 농도
겐타마이신	생명 기술	제15750-060	50ng/mL 최종 농도
트리판 블루	피어스 써모사이언티픽	제15250-061
고밀도 Hubiogel	비보바이오사이언스	HDHG-5
디엠소	어부	BP231	calcein AM & 화합물의 용해를 위해
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(Ca/Mg	코닝(주) Cellgro Mediatech	20-030-이력서	MiliQ 초순수로 1배로 희석(사전 고정 세척용)
10% 중성 완충 포르말린	프로토콜	제032-060
100mm 유리 페트리 접시	어부	08-748디

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