SB 매개 전치를 사용한 교모세포종 유도: 신생아 마우스 뇌에 SB 플라스미드의 전이(Transposon) 매개 통합을 사용하여 새로운 마우스 모델을 생성하는 기술

초록

출처: Calinescu, A. A. et al. 교모세포종의 새로운 모델을 생성하기 위해 신생아 마우스의 뇌실 내 영역에 플라스미드 DNA의 전이 매개 통합. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포손 DNA를 사용하여 교모세포종(GBM)을 유도하는 효율적인 기술을 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하 영역의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.

프로토콜

1. 심실 내 신생아 주사

1. 실험하기 3-4주 전에 수컷 쥐 한 마리와 암컷 쥐 한 마리가 있는 쥐 사육장과 플라스틱 색상의 이글루를 설치합니다. 이것은 풍부한 환경을 제공하고 짝짓기 과정을 돕습니다.
2. 임신이 확인되면 수컷을 새 우리로 옮깁니다. 짝짓기 후에 18 일, 배달을 위해 매일 감금소를 감시하십시오. 출생 후 1일차(P1)에 뇌실 주사를 시행합니다.
3. 주입 용액의 준비.
   참고: 주입 용액은 플라스미드 DNA를 transfection 시약과 혼합하여 transfection을 위한 입자를 생성함으로써 만들어집니다. 다음은 잠자는 숲속의 미녀 전이효소 및 루시퍼라제(pT2/SB100x-Luc)와 두 개의 트랜스포손 플라스미드(pT/CAGGS-NRASV12 및 pT/CMV-SV40-LgT)를 1:2:2의 비율로 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 주입 용액을 제조하는 예입니다. 모든 플라스미드의 농도는 2 μg/μL입니다.
   1. 4 μg/SB100x-Luc 4 μg(2 μL), pT/CAGGS-NRASV12 8 μg(4 μL) 및 pT/CMV-SV40-LgT 8 μg(4 μL) 및 10% 포도당 10 μL를 1 μg/mL DNA 및 5% 포도당 농도에서 최종 부피 20 μL에 추가하여 DNA 용액을 준비합니다.
   2. 2.8μL의 in vivo jet PEI, 7.2μL의 멸균수 및 10μL의 10% 포도당을 5% 포도당의 최종 농도에 첨가하여 PEI 용액을 준비합니다.
   3. PEI 용액을 DNA 용액에 넣고 섞어 와류로 만들고 실온(RT)에서 20분 동안 그대로 둡니다. 이제 용액을 주입할 준비가 되었습니다. RT에서 1시간 후 용액을 얼음 위에 두십시오.
   4. 12.5° 경사가 있는 30G 피하 주사 바늘이 장착된 10μL 깨끗한 주사기를 마이크로 펌프에 끼웁니다(그림 1 #1).
4. 주입 시스템의 적절한 기능을 확인하려면 자동 주입기(그림 1 #1)를 사용하여 10μL의 물을 주사기로 빼낸 다음 주사기를 완전히 비웁니다.
5. 드라이 아이스와 알코올 슬러리로 신생아 입위 단계(그림 1 #3)를 2–8°C의 온도로 냉각합니다.
6. 새끼를 젖은 얼음 위에 2분 동안 올려 마취를 유도합니다. 마취는 절차의 나머지 부분 동안 냉각된 입체 안경테에서 계속됩니다. 프레임의 온도를 영하 이상으로 2–8 °C 사이로 유지하면 열 화상 부상을 방지할 수 있습니다. 특별한 예방 조치로 강아지는 젖은 얼음 위에 놓기 전에 거즈로 감쌀 수 있습니다.
7. 주사기에 DNA/PEI 용액을 채웁니다.
거즈로
8. 덮인 이어바 사이에 머리를 넣어 입체 프레임에서 강아지를 고정시킵니다(그림 1b). 두개골의 등쪽이 수평이고 프레임 표면과 평행하며 두개골 봉합사가 명확하게 보이는지 확인하십시오. 70% 에탄올로 머리를 닦습니다.
9. 주사기의 바늘을 내리고 바늘이 람다(두정골과 후두골의 정중선 교차점)에 닿을 때까지 입체 안경테의 다이얼을 사용하여 입체 좌표를 조정합니다(그림 1b).
10. 바늘을 들어 올리고 입체 좌표를 람다에 대해 0.8mm 측면, 1.5mm 세로 조정합니다(그림 1b).
11. 바늘이 피부에 닿아 약간 보조개가 생길 때까지 바늘을 내립니다. 좌표를 측정합니다. 바늘을 1.5mm 더 내립니다. 바늘은 피부와 두개골을 관통하고 피질을 통과하여 외심실로 들어갑니다(그림 1c).
12. 자동 주입기를 사용하여 0.5μL/분의 속도로 0.75μL의 DNA/PEI 용액을 주입합니다.
13. 용액이 심실로 분산될 수 있도록 강아지를 프레임에 1분 더 두십시오. 그 동안 다음 주사를 준비하기 위해 얼음 위에서 다른 강아지를 2분 동안 마취합니다.
14. 부드럽고 천천히 바늘을 들어 올리고 강아지를 난방 램프 아래에 놓습니다. 호흡과 활동을 모니터링하십시오. 필요한 경우 첫 번째 호흡이 이어질 때까지 팔다리를 부드럽게 자극합니다.
15. 강아지가 워밍업되고, 장밋빛에 도달하고, 규칙적으로 호흡하고, 활동적이며, 일반적으로 5-7분 후에 어미에게 돌려줍니다. 한 번에 두 마리 이상의 새끼를 주사하는 경우 모든 주사가 완료될 때까지 모든 새끼를 함께 두십시오. 주사가 30분 이상 걸리면 처음 30분 후에 강아지의 절반을 돌려보내고 절차가 끝나면 나머지를 돌려보냅니다.
16. 댐이 새끼들에게 반응하고 보살핌을 주는지 모니터링하십시오. 필요한 경우 케이지에 대리모를 추가합니다.
17. 강아지를 얼음 위에 올려 놓는 것과 보온 램프 아래에 놓는 사이의 간격이 10분 미만인지 확인하십시오. 절차가 빠를수록 생존율이 높아집니다. 일반적으로 강아지를 마취하고 주입하는 데 걸리는 시간은 4분입니다.

결과

그림 1: 신생아 마우스의 심실 내 주사를 위한 실험 설정 및 가이드. (가)마이크로미터 다이얼이 있는 입체 프레임(2)에는 10μl 주사기(4)를 고정하는 자동 인젝터가 장착되어 있습니다. U 프레임 내부에는 신생아 어댑터 프레임이 단단히 고정되어 있습니다(3). 자동 주입기의 제어판 (1)은 주사기, 부피 및 유속을 정밀하게 선택할 수 있도록 합니다. (b) 외심실에 주입하는 데 필요한 좌표(복부 1.5mm, 람다 측면 0.8mm)에 바늘을 삽입한 신생아 마우스(P1)의 사진. (c) 신생아 마우스(P1)의 뇌를 통한 관상 절편의 그림으로 상대적인 치수와 위치를 강조합니다. 심실.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Stoelting의 실험실 표준물질(쥐 및 마우스 어댑터 포함)	스톨팅	51670	다른 회사에서도 유사한 프레임을 생산하며 작은 마우스 어댑터가 있는 것이 적합합니다.
Quintessential 입체택시 주입기(QSI)	스톨팅	53311	그것 없이도 주사를 할 수 있지만 자동 인젝터는 재현성과 편의성을 높입니다
10 μL 700 시리즈 수동 장착형 MICROLITER 주사기	해밀턴	모델 701	이 주사기 모델은 0.5 - 500 μL의 용액을 안정적으로 전달합니다. 다른 주사기(예: 5μL, 모델 75)도 사용할 수 있습니다
30게이지 피하 주사 바늘(1.25", 15^{o} 경사)	해밀턴	S/O# 197462	이 바늘은 다른 침습적 절차 없이 신생아 마우스의 피부와 두개골을 관통하는 데 이상적입니다. 무뎌지면(피부에 쉽게 들어가지 않음) 교체해야 합니다.
생체 내 제트 PEI	Polyplus 트랜스펙션(Transfection)	201-10지	소량으로 부분 표본을 만들고 -20ºC에서 유지
D-루시페린, 칼륨 염	Goldbio.com	행운K-1g	반딧불이 루시피라아제의 다른 공급원도 마찬가지로 적절합니다
헤마톡실린 용액, Harris Modified	시그마 알드리치	HHS128-4L