쥐 뇌 혈관 분리: 쥐 뇌 샘플에서 온전한 혈관을 분리하는 프로토콜

초록

출처: Boulay, A. C. et al. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 쥐의 뇌에서 혈액뇌장벽(BBB)을 구성하는 온전한 혈관과 뉴런 및 신경교세포를 분리하는 것을 보여줍니다. 분리된 혈관은 뇌 항상성을 유지하는 데 있어 혈관의 역할을 연구하기 위한 체외 모델로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 해부

참고: 세포 배양 목적으로 용기를 사용하지 않는 한 멸균 조건이 필요하지 않습니다. 분리 용기 용액 준비 : B1, HBSS 150 mL에 HEPES 1M 1.5 mL를 첨가하십시오. B2, B1 20mL에 덱스트란 3.6g을 첨가합니다. B3, B100 mL에 BSA 1 g을 첨가합니다.

1. B150 mL와 B1 20 mL를 준비합니다. 공기 오염을 방지하기 위해 얼음 위에 보관하고 파라필름으로 덮으십시오.
2. 케이지에 첨가된 순수한 이소플루란 1mL에 적신 작은 종이 타월로 후드 아래에서 마우스를 깊이 마취시킵니다. 마취는 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는 것으로 확인됩니다. 경추 탈구로 마우스를 죽입니다.
   메모: 이러한 단계는 국가 및 기관 규정에 따라 수행됩니다.
3. 선택 사항: 혈액 함량을 제거하기 위해 20mL의 PBS 1x로 심장 내 관류를 수행합니다.
4. 메스로 목에서 코까지 피부를 절개하고 당겨 빼냅니다. PBS 1x로 오염된 모든 모발을 제거하십시오.
5. 두개골을 열려면 먼저 가위를 후각구 앞쪽에 삽입하고 가위를 열어 두개골을 두 부분으로 파열시킵니다.
6. 뇌 주걱을 사용하여 조심스럽게 뇌를 제거합니다. 맥락막신경총(choroid plexus)을 외측심실(lateral cortricles)에서 절개하면 혈관 제제를 오염시킬 수 있습니다.
   메모: 선택 사항: 최종 준비에는 실질 및 수막 혈관이 포함됩니다. 원하지 않는 경우 수막을 벗길 수 있습니다.
7. 얼음 위에 B1 용액이 들어 있는 비커로 뇌를 옮깁니다. 최대 8개의 뇌를 함께 치료할 수 있습니다.

2. 뇌 조직 균질화

1. 두 개의 메스를 사용하여 B1 용액에서 수동으로 그리고 격렬하게 뇌를 두드려 약 2mm의 작은 조각을 얻습니다.
2. 자동화된 Dounce 균질기로 준비물을 균질화하여 400rpm에서 20회 스트로크를 수행합니다. 유리관이 얼음 속에 유지되고 위아래로 움직일 때 douncer의 상부가 용액에 있는지 확인하여 공기 주머니가 형성되는 것을 방지하십시오. 여러 샘플이 준비된 경우 각 균질화 사이에 이온수로 douncer를 세척합니다.

3. 혈관 정화

1. 균질액을 50mL 플라스틱 튜브에 옮기고 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 원심분리를 진행합니다. 큰 흰색 계면(대부분 미엘린)이 혈관 펠릿 상단에 형성됩니다(관류가 수행되지 않은 경우 빨간색).
2. 상등액을 버리십시오. 혈관 펠릿과 흰색 인터페이스는 함께 부착된 상태로 유지됩니다. 얼음처럼 차가운 B2 용액 20mL를 넣고 튜브를 1분 동안 수동으로 세게 흔듭니다.
3. 4,400 x g에서 4°C에서 15분 동안 두 번째 원심분리를 진행합니다. 미엘린은 이제 상층액의 표면에 조밀한 흰색 층을 형성합니다.
4. 튜브를 잡고 천천히 회전시켜 상등액이 벽을 통과할 수 있도록 튜브 벽에서 미엘린 층을 조심스럽게 분리합니다. 상등액과 함께 수초를 버립니다. 혈관을 포함하는 펠릿은 튜브 바닥에 부착된 상태로 남아 있습니다.
5. 5mL 플라스틱 피펫을 감싼 흡수지로 튜브의 내벽을 닦아내고 잔류 액체를 모두 제거하고 용기 펠릿을 만지지 마십시오. 튜브를 흡수성 종이 위에 거꾸로 올려 남아 있는 액체를 배출하십시오.
6. 바인딩이 낮은 팁으로 위아래로 피펫팅하여 튜브를 얼음 위에 유지한 다음 B3 용액 5mL를 더 추가하여 얼음처럼 차가운 B3 용액 1mL에 펠릿을 현탁시킵니다. 혈관이 가능한 한 많이 분산되어 있는지 확인하고 응집체를 형성하지 마십시오.

4. 여과

1. 얼음처럼 차가운 B3 용액 30mL를 넣은 얼음 위에 비커를 준비합니다. 공기 오염을 피하기 위해 파라필름으로 덮으십시오.
2. 20μm 메쉬 필터를 becker 플라스크 상단의 개조된 필터 홀더에 놓고 10mL의 얼음처럼 차가운 B3 용액을 도포하여 평형을 이룹니다.
3. 용기 준비물을 필터에 붓고 얼음처럼 차가운 B3 용액 40mL로 용기를 헹굽니다.
4. 깨끗한 집게를 사용하여 필터를 회수하고 즉시 B3 용액이 들어 있는 비커에 담그십시오. 필터를 부드럽게 흔들어 필터에서 용기를 분리합니다.
5. 50mL 플라스틱 튜브에 비커 내용물을 붓고 2,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   메모: 또는 3.6단계의 뇌 혈관 현탁액을 100μm 메쉬 필터로 필터링할 수 있습니다. 이 경우 더 큰 용기는 필터에 우선적으로 유지되는 반면 플로우 스루에는 미세 용기(주로 모세관)가 포함되어 있으며, 이러한 용기는 위와 같이 20μm 메쉬 필터에서 필터링됩니다.
6. 1 mL의 얼음처럼 차가운 B3 용액에 microvessel pellet을 재현탁하고 1.5 mL Eppendorf tube에 피펫팅하여 옮깁니다. 2,000 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
티슈 그라인더 사이즈 C	토마스 사이언티픽	3431E25
원심분리기 5415 R Eppendorf
Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
고성능, 모듈식 실체현미경	라이카 MZ6
낮은 바인딩 팁(P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47mm 필터 홀더 PP 8/Pk	밀리포어	SX0004700
나일론 네트 필터 디스크 친수성 20 μm 47 mm 100/Pk	밀리포어	NY2004700
나일론 네트 필터 디스크 친수성 100 μm 47 mm 100/Pk	밀리포어	NY1H04700
파라필름 M(롤 크기 4인치 × 125피트)	시그마	P7793-1개
HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음	생명 기술	14175-129
헤페스 (1M)	생명 기술	15630056
Leuconostoc spp.의 덱스트란 씨 ~70,000	시그마	31390
소 혈청 알부민	시그마	A2153
PBS 10배	유로메덱스	ET330

년