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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 해부
참고: 세포 배양 목적으로 용기를 사용하지 않는 한 멸균 조건이 필요하지 않습니다. 분리 용기 용액 준비 : B1, HBSS 150 mL에 HEPES 1M 1.5 mL를 첨가하십시오. B2, B1 20mL에 덱스트란 3.6g을 첨가합니다. B3, B100 mL에 BSA 1 g을 첨가합니다.
- B150 mL와 B1 20 mL를 준비합니다. 공기 오염을 방지하기 위해 얼음 위에 보관하고 파라필름으로 덮으십시오.
- 케이지에 첨가된 순수한 이소플루란 1mL에 적신 작은 종이 타월로 후드 아래에서 마우스를 깊이 마취시킵니다. 마취는 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는 것으로 확인됩니다. 경추 탈구로 마우스를 죽입니다.
메모: 이러한 단계는 국가 및 기관 규정에 따라 수행됩니다.
- 선택 사항: 혈액 함량을 제거하기 위해 20mL의 PBS 1x로 심장 내 관류를 수행합니다.
- 메스로 목에서 코까지 피부를 절개하고 당겨 빼냅니다. PBS 1x로 오염된 모든 모발을 제거하십시오.
- 두개골을 열려면 먼저 가위를 후각구 앞쪽에 삽입하고 가위를 열어 두개골을 두 부분으로 파열시킵니다.
- 뇌 주걱을 사용하여 조심스럽게 뇌를 제거합니다. 맥락막신경총(choroid plexus)을 외측심실(lateral cortricles)에서 절개하면 혈관 제제를 오염시킬 수 있습니다.
메모: 선택 사항: 최종 준비에는 실질 및 수막 혈관이 포함됩니다. 원하지 않는 경우 수막을 벗길 수 있습니다.
- 얼음 위에 B1 용액이 들어 있는 비커로 뇌를 옮깁니다. 최대 8개의 뇌를 함께 치료할 수 있습니다.
2. 뇌 조직 균질화
- 두 개의 메스를 사용하여 B1 용액에서 수동으로 그리고 격렬하게 뇌를 두드려 약 2mm의 작은 조각을 얻습니다.
- 자동화된 Dounce 균질기로 준비물을 균질화하여 400rpm에서 20회 스트로크를 수행합니다. 유리관이 얼음 속에 유지되고 위아래로 움직일 때 douncer의 상부가 용액에 있는지 확인하여 공기 주머니가 형성되는 것을 방지하십시오. 여러 샘플이 준비된 경우 각 균질화 사이에 이온수로 douncer를 세척합니다.
3. 혈관 정화
- 균질액을 50mL 플라스틱 튜브에 옮기고 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 원심분리를 진행합니다. 큰 흰색 계면(대부분 미엘린)이 혈관 펠릿 상단에 형성됩니다(관류가 수행되지 않은 경우 빨간색).
- 상등액을 버리십시오. 혈관 펠릿과 흰색 인터페이스는 함께 부착된 상태로 유지됩니다. 얼음처럼 차가운 B2 용액 20mL를 넣고 튜브를 1분 동안 수동으로 세게 흔듭니다.
- 4,400 x g에서 4°C에서 15분 동안 두 번째 원심분리를 진행합니다. 미엘린은 이제 상층액의 표면에 조밀한 흰색 층을 형성합니다.
- 튜브를 잡고 천천히 회전시켜 상등액이 벽을 통과할 수 있도록 튜브 벽에서 미엘린 층을 조심스럽게 분리합니다. 상등액과 함께 수초를 버립니다. 혈관을 포함하는 펠릿은 튜브 바닥에 부착된 상태로 남아 있습니다.
- 5mL 플라스틱 피펫을 감싼 흡수지로 튜브의 내벽을 닦아내고 잔류 액체를 모두 제거하고 용기 펠릿을 만지지 마십시오. 튜브를 흡수성 종이 위에 거꾸로 올려 남아 있는 액체를 배출하십시오.
- 바인딩이 낮은 팁으로 위아래로 피펫팅하여 튜브를 얼음 위에 유지한 다음 B3 용액 5mL를 더 추가하여 얼음처럼 차가운 B3 용액 1mL에 펠릿을 현탁시킵니다. 혈관이 가능한 한 많이 분산되어 있는지 확인하고 응집체를 형성하지 마십시오.
4. 여과
- 얼음처럼 차가운 B3 용액 30mL를 넣은 얼음 위에 비커를 준비합니다. 공기 오염을 피하기 위해 파라필름으로 덮으십시오.
- 20μm 메쉬 필터를 becker 플라스크 상단의 개조된 필터 홀더에 놓고 10mL의 얼음처럼 차가운 B3 용액을 도포하여 평형을 이룹니다.
- 용기 준비물을 필터에 붓고 얼음처럼 차가운 B3 용액 40mL로 용기를 헹굽니다.
- 깨끗한 집게를 사용하여 필터를 회수하고 즉시 B3 용액이 들어 있는 비커에 담그십시오. 필터를 부드럽게 흔들어 필터에서 용기를 분리합니다.
- 50mL 플라스틱 튜브에 비커 내용물을 붓고 2,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
메모: 또는 3.6단계의 뇌 혈관 현탁액을 100μm 메쉬 필터로 필터링할 수 있습니다. 이 경우 더 큰 용기는 필터에 우선적으로 유지되는 반면 플로우 스루에는 미세 용기(주로 모세관)가 포함되어 있으며, 이러한 용기는 위와 같이 20μm 메쉬 필터에서 필터링됩니다.
- 1 mL의 얼음처럼 차가운 B3 용액에 microvessel pellet을 재현탁하고 1.5 mL Eppendorf tube에 피펫팅하여 옮깁니다. 2,000 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기.