병아리 배아 소뇌 절편의 생체 외 전기천공법: 과립 세포 발달을 시각화하기 위해 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드 DNA를 도입하는 방법

초록

출처: Hanzel, M. et al.병아리 소뇌 절편의 ex vivo 배양 및 과립 세포 전구체의 공간적 표적 전기천공법.J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오에서는 리포터 유전자 플라스미드를 사용하여 병아리 배아 소뇌 절편의 전기천공을 수행합니다. 이 기술은 과립층을 형성하기 위해 과립 세포 전구체의 발달 및 이동에 대한 시각화를 용이하게 합니다.

프로토콜

1. 슬라이스의 Electroporation

1. electroporator의 양극을 절연 테이프로 60mm Petri 접시의 바닥에 고정하여 electroporation 챔버를 구성합니다. 전극을 덮기 위해 약 1mL의 HBSS를 추가합니다.
2. HBSS로 덮인 전극 위에 0.4μm 배양 삽입물을 놓습니다. 배양 삽입물이 전극에 놓이도록 하여 삽입물과 전극 사이에 항상 접촉이 있는지 확인합니다.
   메모: 이 설정에서 슬라이스가 있는 배양 인서트는 용액 표면에 놓여 회로를 유지하지만 음극의 공간적 타겟팅을 허용합니다.
3. 절단 팁이 있는 3mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 식별된 슬라이스(배양 삽입물당 최대 5개)를 배양 삽입물로 옮깁니다. 분리하여 배양에 정착 할 수 있도록 시상 방향으로 삽입합니다.
4. 피펫을 사용하여 과도한 HBSS를 제거하여 슬라이스가 더 이상 용액에 담그지 않도록 합니다.
5. P10 피펫 팁을 사용하여 피펫 DNA(1 μg/μL 농도)를 슬라이스의 대상 영역 표면에 20% 패스트 그린으로 희석합니다.20% 패스트 그린은 점성 DNA 용액을 보장하고 DNA의 엄청나게 넓은 분산을 방지합니다. 각 슬라이스에 약 5μL DNA/빠른 ....

결과

형태 1. 설치된 electroporation 약실. (A) 주문품 electroporation 약실의 그림. 챔버는 60mm 페트리 접시의 바닥에 단단히 배치된 전기천공기의 양극으로 구성됩니다. 접시에는 전극을 덮기 위해 약 1mL의 HBSS가 들어 있습니다. 배양 인서트는 인서트와 전극 사이에 일정한 접촉을 유지하면서 전극에 놓여야 하며, 회로를 유지하되 수동으로 조작하는 음극의 공간적 타겟팅을 허용해야 합니다. (B) 전기천공이 이루어지는 슬라이스의 사진. 슬라이스는 DNA/패스트 그린 용액으로 덮여 있습니다. 슬라이스는 원하는 대로 전기천공됩니다: 전기천공은 하나의 폴리움 또는 여러 위치를 대상으로 할 수 있습니다. 전기천.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
기저 매체 독수리(Gibco)	생명 기술	제41010-026
L-글루타민	시그마	G7513
페니실린/스트렙토마이신	시그마	P4333
0.4 μm 배양 인서트	밀리포어	PICM0RG50
TSS20 오보다인 전기천공기	인트라셀	01-916-02	electroporation을 위해 3 x 10 V 10 msec 펄스를 사용합니다.

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