소뇌 절제 및 절편 준비: 마우스 소뇌에서 조직 절편을 생성하는 방법

초록

출처: Thetiot, M. et al. 수초성 유기형 소뇌 절편 배양의 준비 및 면역 염색. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 마우스 소뇌에서 조직 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 소뇌 절편은 수초화 역학을 포함한 신경 발달 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 유기형 배양에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 소뇌 절제 및 절편 준비 (실습 시간 ≈ 동물 당 15-20분)

1. 얼음처럼 차가운 해부 매체가 들어 있는 60mm 세포 배양 접시 중 하나를 쌍안 현미경 아래에 놓고 상판을 제거합니다.
2. 머리 털을 70% 에탄올로 면봉으로 닦고(동물의 눈을 만지지 않도록 주의) 승인된 절차에 따라 크고 날카로운 가위를 사용하여 동물의 목을 베십시오.
   참고: 소뇌 절편은 특정 성별 또는 변형 편향 없이 P9-P10 마우스에서 생성됩니다.
3. 작은 가위를 사용하여 목에서 시작하여 쥐 주둥이까지 머리의 정중선을 따라 피부를 자릅니다.
4. 머리를 잡고 두개골을 드러내려면 머리 아래의 배쪽 피부를 뒤로 접고 손가락 사이로 두 겹의 피부를 꼬집습니다.
5. 작은 가위를 구멍(foramen magnum)에 부드럽게 삽입하고 옆으로 한쪽 측면을 절개하여 두개골을 자른 다음 머리 두개골 주위를 모두 자릅니다. 절단하는 동안 가위 끝을 가능한 한 두개골에 평행하고 가깝게 유지하여 뇌 조직이 손상되지 않도록 하십시오.
6. 가늘고 곧은 집게를 사용하여 두개골의 등쪽 부분을 회수합니다. 두개골의 등쪽 부분을 조심스럽게 들어 올리면서 뇌 조직이 손상되지 않도록 필요한 경우 작은 가위로 부착 된 수막을 자릅니다.
7. 복부 두개골과 뇌 사이에 가는 곧은 겸자(또는 주걱 사용)를 조심스럽게 삽입하고 뇌를 부드럽게 뒤집어 작은 가위로 시신경과 삼차 신경을 자릅니다.
8. 접시 바로 위에 있는 머리를 거꾸로 뒤집어 얼음처럼 차가운 해부 매체가 들어 있는 60mm 세포 배양 접시에 뇌가 중력에 의해 떨어지도록 돕고 필요한 경우 작은 가위로 마지막 접착을 해제합니다.
9. 가는 집게를 사용하여 등쪽이 연구자를 향하고 복부 쪽이 접시 바닥에 놓이도록 뇌의 방향을 잡습니다.
10. 양안 현미경 아래에서 가는 직선 겸자를 사용하여 전뇌 쪽의 뇌를 고정하고 뒷뇌가 손상될 수 있으므로 만지지 마십시오. 가늘고 곧은 겸자를 사용하여 뒷뇌를 뇌의 나머지 부분(앞뇌와 중뇌, 그림 1Aa의 개략도 참조)과 분리합니다. 소뇌를 뒷뇌의 나머지 부분과 분리하려면 가는 집게를 사용하여 소뇌 아래의 소뇌 꽃자루를 자릅니다(그림 1Aa'의 개략도 참조).
11. 소뇌가 분리되면 가는 직선 집게를 사용하여 수막을 조심스럽게 뜯어냅니다(그림 1Aa'의 개략도 참조).
12. 가늘고 구부러진 집게로 소뇌를 부드럽게 잡고 등쪽이 위로 향하게 하여 다지기 면도날에 수직으로 플라스틱 플랫폼에 놓습니다(그림 1Bb의 개략도 참조).
13. 1mL 피펫에 맞게 조정된 멸균 얇은 피펫 팁을 사용하여 소뇌 주위의 과도한 박리 매체를 흡인합니다(그림 1Bb의 도식 참조).
14. 소뇌가 평평하게 놓여 있지만 플랫폼에 놓인 후에는 늘어나지 않도록 하여 절편 중에 최적의 시상 절편을 얻습니다(그림 1Bb의 개략도 참조).
15. 조직 다지기로 소뇌의 300μm 두께의 시상 부분을 절단합니다(그림 1Bb'의 개략도 참조). 블레이드의 힘과 속도는 현장에서 최적화되어야 합니다.
16. 얇게 썬 소뇌에 박리 배지 한 방울을 부드럽게 떨어뜨립니다. 1mL 피펫에 놓인 광경 피펫 팁을 사용하여 얇게 썬 소뇌를 천천히 흡인하고 얼음처럼 차가운 해부 배지가 들어 있는 60mm 세포 배양 접시에 다시 옮깁니다(그림 1Bb''의 개략도 참조).
17. 각 소뇌 슬라이스 사이에 100% 에탄올로 티슈 초퍼의 플라스틱 플랫폼을 청소합니다. 다음 소뇌를 플랫폼에 놓기 전에 에탄올을 증발시킵니다.
18. 두 개의 가는 직선 집게(또는 티타늄 바늘)를 사용하여 개별 조각을 분리하고 vermis에서 6-8개의 조각을 선택합니다(그림 1Cc 및 1Cc'의 개략도 참조).
19. 배양 인서트가 있는 6웰 플레이트를 가져와서 1mL 피펫에 적용된 광폭 피펫 팁을 사용하여 선택한 슬라이스를 일부 박리 매체와 함께 하나의 배양 삽입물로 옮깁니다(그림 1Cc'의 개략도 참조).
20. 해부 매체 또는 집게를 사용하여 배양 삽입물의 중간에 슬라이스를 놓고 서로 접촉하지 않도록 올바른 위치로 부드럽게 밀고 당깁니다(그림 1Cc'의 개략도 참조).
21. 얇은 피펫 팁을 사용하여 슬라이스 주변의 과도한 해부 매체를 제거합니다. 조각이 멤브레인에 평평하게 놓여 있는지 확인합니다(그림 1Cc'의 개략도 참조).
22. 멤브레인에 슬라이스를 추가한 직후 6웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

결과

그림 1: 소뇌 절편 생성의 그림. 해부는 세 가지 주요 단계로 나뉩니다. (A) 소뇌를 분리하고 수막을 제거합니다(단계 1.10 및 1.11). (B) 그런 다음 소뇌를 초퍼 플랫폼으로 옮겨 절편화합니다(단계 1.12 - 1.16). (C) 마지막으로, 슬라이스를 vermis에서 분리하여 멤브레인 인서트에 놓습니다. 슬라이스와 함께 전달된 해부 매체를 제거하고 6웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다(단계 1.18 및 1.22).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BME 매체	써모피셔 사이언티픽	41010026
Hank's Balanced Salt Solution(HBSS 10개)	써모피셔 사이언티픽	14180046
글루타맥스 (100배)	써모피셔 사이언티픽	35050038
열 비활성화 호스 세럼	써모피셔 사이언티픽	26050088
페니실린-스트렙토마이신(10.000IU/mL)	써모피셔 사이언티픽	15140122
Gey의 균형 잡힌 소금 용액	시그마 알드리치	G9779-500ML
D-글루코스 용액 (45%)	시그마 알드리치	G8769-100ML
파라포름알데히드(PFA)	전자 현미경 과학	15714
앱솔루트 에탄올(100% 에탄올)	VWR 화학 물질	20821.33
트리톤® X-100	시그마 알드리치	엑스100-500ML	-20°C에서 냉각
10% 노멀 염소 혈청(NGS)	써모피셔 사이언티픽	500622
인산염 완충 용액	유로메덱	ET330-A
티슈 다지기	맥일완		산도 7.4
면도날
큰 가위	F.S.T	14101-14
작은 가위	F.S.T	91500-09
가는 직선 집게	F.S.T	91150-20
곡선형 가는 집게	F.S.T	11297-00
세포 배양 접시(60mm 및 100mm)	증권 시세
4웰, 6웰 배양 플레이트	증권 시세
밀리셀 배양 삽입물(0,4 μm, 직경 30 mm)	머크 밀리포어	PICM0RG50
세포 배양 인큐베이터
미세한 피펫 팁	더처	134000CL	37°C, 5% 이산화탄소2
광구경 피펫 팁	써모피셔 사이언티픽	2079지
멸균 주사기	테루모 유럽
멸균 주사기 필터	테루모 유럽		20 또는 50 mL
메스	스완-모튼	510	0.22 μm의
브러시
현미경 슬라이드	RS 프랑스
유리 커버 슬립	RS 프랑스		76mm x 26mm x 1.1mm
Kimtech Sciences 조직 와이퍼	킴벌리-클라크 프로페셔널	5511	22mm x 22mm
쌍안 현미경