Organotypic Brain Slice Cultures의 Single Cell Electroporation: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices(유기형 뇌 슬라이스 배양에서의 단세포 전기천공법: 뇌 해마 슬라이스의 표적 뉴런 내부에 플라스미드를 전달하는 체외 기술)

초록

출처: Keener, D. G. et al. 마우스 해마 흥분성 및 클래스 특이적 억제 뉴런의 다양한 유기형 슬라이스 배양에 걸친 단일 세포 전기천공법. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오는 다양한 체외 해마 절편 배양에서 흥분성 및 억제성 뉴런 모두에 있는 유전자의 단세포 전기천공을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 기술은 세포 자율 메커니즘 및 시냅스 전달 단백질 상호 작용을 포함하여 뉴런의 특정 분자 및 생리학적 기능을 검사하는 데 유용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 슬라이스 배양 준비

1. 암수 중 어느 한 마리의 출생 후 6-7일 된 마우스를 사용하여 마우스 유기형 해마 절편 배양을 준비합니다.
   1. (mM 단위) : 238 자당, 2.5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ 및 11 포도당으로 구성된 유기형 슬라이스 배양을 위한 해부 매체를 탈이온수에 제조한 다음 5% CO₂/95% O₂를 pH 7.4로 가스화합니다.
   2. 78.8%(v/v) 최소 필수 배지 독수리, 20%(v/v) 말 혈청, 17.9mM NaHCO₃, 26.6mM 포도당, 2M CaCl₂, 2M MgSO₄, 30mM HEPES, 인슐린(1μg/mL) 및 0.06mM 아스코르브산으로 구성된 유기형 슬라이스 배양 배지를 준비합니다. 삼투압계를 사용하여 삼투압을 310–330 osmol로 조정합니다.
   3. 두 개의 주걱을 사용하여 뇌 전체에서 해마를 해부하고 조직 초퍼를 사용하여 400μm를 절단합니다. 두 개의 집게를 사용하여 절편을 분리하고 삽입물 아래에 배양 배지(950μL)로 채워진 6웰 플레이트에 30mm 세포 배양 삽입물로 옮깁니다.
2. 유기형 절편 배양액을 조직 배양 인큐베이터(35°C, 5% CO₂)에 보관하고 절편 배양 배지를 이틀에 한 번씩 교체합니다.

2. 플라스미드 준비

1. 관심 유전자에 대한 플라스미드를 준비합니다.
   1. 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자를 pCAG 벡터로 서브클론합니다.
   2. 내독소가 없는 정제 키트로 pCAG-EGFP 플라스미드를 정제하고 140mM K-메탄설포네이트, 0.2mM EGTA, 2mM MgCl₂ 및 10mM HEPES를 함유한 디에틸 피로탄산염 처리된 물로 구성된 내부 용액에 용해시키고 KOH(플라스미드 농도: 0.1μg/μL)로 pH 7.3으로 조정합니다.

3. 유리 피펫 준비

1. 마이크로피펫 풀러(그림 1A)에서 붕규산 유리 피펫(4.5–8MΩ)을 당깁니다(그림 1A).
   메모: 전체 셀 패치 클램프 기록에 사용되는 유리 피펫은 전기천공법에 이상적입니다.
2. 유리 피펫을 200°C에서 밤새 굽고 살균합니다.
3. 해부 현미경으로 피펫 팁의 크기를 확인하여 전기 저항을 근사화합니다.
   1. 선택 사항: 피펫을 전기천공법 전극에 부착하여 피펫 저항성을 확인하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 팁을 필터 멸균 인공 뇌척수액(aCSF)으로 이동시킵니다(mM 단위): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ 및 11 포도당, 5% CO₂/95% O₂로 가스화된 포도당pH 7.4까지. electroporator.
      의 판독값을 사용하여 실제 저항을 확인합니다. 메모: 피펫 팁이 날카로울수록 전기 저항이 커집니다. 피펫 저항은 10MΩ 미만이어야 합니다. 높은 피펫 저항성을 가진 유리 피펫(그림 1B)은 반복적인 전기천공법 중에 팁이 막히는 경우가 많습니다.

4. Electroporation Rig 설정

1. micromanipulator와 연동 펌프가 있는 이동 테이블에 장착된 정립 현미경이 장착된 표준 전체 세포 전기생리학 장비에 electroporator를 설치합니다.
2. 헤드를 설치하세요.tage electroporator의 micromanipulator에 연결하고 한 쌍의 스피커를 electroporator에 연결합니다. electroporator를 풋 페달에 연결하면 준비가 되었을 때 펄스를 보내는 데 사용할 수 있습니다.
   메모: 스피커는 켜져 있을 때 신호음을 내는데, 이는 전극의 전기 저항을 나타내는 지표입니다. 이를 통해 절차에서 주의를 분산시키지 않고 저항의 상대적 변화를 결정할 수 있습니다.

5. 전기천공법 준비

1. 6웰 플레이트의 slice 배양 삽입물을 900μL의 배양 배지가 적재된 3cm 페트리 접시로 옮기고 전기천공을 수행할 준비가 될 때까지 탁상용 CO₂ 인큐베이터에 보관합니다.
   1. 전기천공법 후 슬라이스를 배양하기 위해 3.5cm 페트리 접시에서 최소 30분 동안 슬라이스 배양 배지(1mL)로 신선한 배양 삽입물을 사전 배양합니다.
2. 전기천공을 위해 장비를 청소하고 준비합니다.
   1. 하루 동안 실험을 시작하기 전에 튜브와 챔버를 살균하기 위해 10% 표백제로 라인을 5분 동안 관류합니다.
   2. 완전히 헹구기 위해 최소 30분 동안 탈이온화된 오토클레이브 물로 라인을 관류합니다.
   3. 0.001mM 테트로도톡신(TTX).
      을 함유한 필터 멸균 aCSF로 라인을 관류합니다. 메모: TTX는 중간뉴런의 과흥분으로 인한 세포 독성 및 사멸을 최소화합니다.
3. electroporator의 펄스 매개변수를 설정합니다: 진폭 -5V, 사각 펄스, 500ms의 트레인, 50Hz의 주파수, 500μs의 펄스 폭.
4. 유리 피펫에 5μL의 플라스미드 함유 내부 용액을 채웁니다.
   1. 팁을 여러 번 가볍게 두드리고 부드럽게 두드려 피펫 팁에 갇힌 기포를 제거합니다.
   2. 해부 현미경으로 팁을 시각화하거나 3.3.1단계를 반복하여 피펫 저항을 확인하여 팁이 손상되지 않았는지 확인합니다.
      메모: 팁이 손상된 경우 유리 피펫을 폐기해야 하며, 3단계에서 이전에 준비한 새 유리 피펫으로 이 단계를 반복해야 합니다.
5. 피펫 팁을 전극에 단단히 부착하고 스피커를 켭니다. 팁이 aCSF 매체와 접촉했을 때 electroporator의 판독값(피펫의 저항)을 기록합니다.
6. 날카로운 칼날을 사용하여 배양 삽입 멤브레인을 절단하고 한 슬라이스 배양을 분리하십시오. 날카롭게 각진 집게를 사용하여 슬라이스 배양액을 전기천공실 챔버로 조심스럽게 옮기고 슬라이스 앵커로 위치를 고정합니다.
   1. 신경 세포의 건강이나 기능 변화와 같은 부작용을 방지하기 위해 한 번에 30분 이상 인큐베이터 밖에서 슬라이스 배양액을 보관하지 마십시오.

6. 관심 세포를 전기천공레이트합니다

.

1. 입으로 피펫에 양압을 가하거나 튜브에 부착된 1mL 주사기(0.2–0.5mL 압력)를 사용하여 피펫에 양압을 가합니다.
2. 마이크로 매니퓰레이터의 3차원 손잡이 컨트롤을 사용하여 슬라이스 배양 표면 근처에서 피펫 팁을 움직입니다.
3. 표적 세포를 선택하고 현미경에서 볼 수 있는 세포 표면에 딤플이 형성될 때까지 가해진 양압을 유지하면서 표적 세포에 접근합니다.
4. 압력 사이클을 수행합니다.
   1. 입으로 약한 음압을 빠르게 가하여 피펫 팁과 원형질막 사이에 느슨한 밀봉이 형성되도록 하며, 이는 피펫 팁으로 다소 올라가는 멤브레인으로 시각적으로 표시됩니다. 스피커에서 나오는 톤의 증가에 귀를 기울여 피펫 저항의 증가(초기 저항의 ~2.5배)를 관찰합니다. 딤플이 다시 형성되도록 양압을 빠르게 다시 가하십시오.
   2. 일시 중지하지 않고 즉시 최소 두 번의 압력 사이클을 더 완료한 다음 1초 동안 음압을 유지합니다.
      메모: 주기 사이에 일시 중지하거나, 너무 많은 압력을 가하거나, 음압을 너무 오래 유지하면 심각한 세포 손상이 발생할 수 있으며 전기천공법 중에 세포가 사멸할 수 있습니다.
5. 스피커의 톤이 피치의 안정적인 정점에 도달하면 풋 페달을 사용하여 electroporator를 한 번 빠르게 펄스하여 최대 전기 저항을 나타냅니다. 펄스를 보내기 전에 최대 저항에서 1초 이상 기다리지 마십시오.
   메모: 우리는 이 프로토콜을 사용할 때 off-target electroporation을 관찰하지 않았습니다. 압력 사이클 동안 유리 피펫과 접촉한 세포만 transfection되었습니다. 피펫을 다른 뉴런 근처에 배치해도 유전자 형질주입이 발생하지 않습니다.
6. 압력을 가하지 않고 피펫을 셀에서 약 100μm 정도 부드럽게 집어넣습니다.
7. 양압을 다시 가하여 저항이 5.5단계에서 기록된 판독값과 유사한지 확인한 후 다음 셀에 접근합니다.
   1. 양압을 가하여 시각적으로 또는 전기천공 후 현저히 증가한(>15% 더 높은) 피펫 저항으로 표시되는 잠재적인 막힘을 제거합니다.
      메모: 눈에 띄는 막힘이 없고 저항이 여전히 훨씬 높으면 피펫을 버리고 새 피펫을 사용하십시오. 평균적으로 피펫은 사용자가 주의할 경우 최대 20회의 electroporation 이벤트에 사용할 수 있습니다.

전기천공(electroporation) 후, 슬라이스 배양액을 새로운 배양 삽입물에 옮기고 35°C의 인큐베이터에서 최대 3일 동안 배양합니다.

결과

그림 1: 두 개의 대표적인 유리 피펫 이미지. (A) 이 프로토콜에 사용되는 더 낮은 저항(6.5 MΩ) 피펫과 (B) 전기천공법 프로토콜에 일반적으로 사용되는 더 높은 저항(10.4 MΩ) 피펫을 표시합니다.

그림 2: 유기형 해마 절편 배양은 세 가지 다른 시점에서 EGFP(녹색)로 전기천공되었습니다. (A) DIV7 Pv/TdTomato 마우스의 대표적인 유기형 해...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스미드 제제
플라스미드 정제 키트	키아겐	12362
유기형 슬라이스 배양 준비
6웰 플레이트	GREINER 바이오-원	657160
Dumont #5/45 집게	증권 시세	#5/45	유기형 슬라이스 배양 준비를 위한 각진 해부 겸
플라스크 필터 유닛	밀리포어	SCHVU02RE	배양 배지의 여과 및 보관
부 화기	바인더	BD C150-UL
McIlwain 조직 초퍼	테드 펠라, INC.	10180	유기형 슬라이스 배양 준비를 위한 조직 다지기
밀리셀 세포 배양 인서트, 30mm	밀리포어	PIHP03050	유기형 슬라이스 배양 인서트
삼투압계	정밀 시스템	오스메트 II
PTFE 코팅 주걱	콜-파머	SK-06369-11
가위	증권 시세	14958-09
스테레오 현미경	올림푸스	SZ61
멸균 진공 여과 시스템	밀리포어	SCGPT01RE	aCSF의 여과 및 보관
전극 준비
모세관 안경	워너 인스트루먼트	640796
마이크로피펫터 풀러	셔터 계기	P-1000	끌어당기는 사람
오븐	바인더	BD (E2)
풀러 필라멘트	셔터 계기	FB330B	끌어당기는 사람
3.5mm 팔콘 페트리 접시	BD 팔콘	353001
에어테이블	티엠씨	63-7512E
CCD 카메라	Q 이미징	레티가-2000DC	사진기
Electroporation 체계	분자 장치	액소포레이터 800A	전기포레이터
형광 조명 시스템	이전의	루멘 200
조작자	셔터 계기	MPC-385	조작자
변형 소프트웨어	분자 장치		이미지 획득
연동 펌프	라이닌	다이나맥스, RP-2	관류 펌프
테이블 이동	루이그스 & 노이만	240 XY
연설자	알려지지 않은		electroporator에 연결된 스피커
스테레오 현미경	올림푸스	SZ30
탁상용 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	미디 40
정립 현미경	올림푸스	BX61WI

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