Spinal Cord Neuron Isolation: In Vitro Studies를 위해 신생아 척수 뉴런을 분리하기 위한 밀도 구배 절차

Summary

[여기에 FIGURE1 삽입]

그림 1: 생후 3일 된 신생아 마우스에서 척추 절개 및 척수 방출. (a)의 화살표는 척추의 꼬리 끝을 가리키며, 여기서 바늘을 삽입하여 척수를 풀어줍니다. 방출된 척수(b)는 PBS에 잠긴 것으로 표시됩니다.

[여기에 FIGURE2 삽입]

그림 2: 밀도 구배, 원심분리 후 세포가 추가된 경우. 레이어는 윤곽이 그려지고 만화 묘사에서 더 잘 시각화됩니다. 가장 표면적인 층(0)은 일반적으로 척수 조직의 파편입니다. 레이어 1은 희소돌기아교세포와 성상세포가 풍부합니다. 레이어 2와 3에는 대부분의 뉴런이 포함되어 있습니다. 레이어 3에는 순도가 가장 높은 뉴런이 포함되어 있지만 일부 지지 세포(즉, 성상세포와 희소돌기아교세포)는 레이어 2에서 발견됩니다. 바닥의 펠릿에는 주로 미세아교세포가 포함되어 있습니다.

Abstract

출처: Eldeiry, M. et al. 신생아 마우스의 척수 뉴런 분리 및 배양. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오에서는 체외 연구를 위해 신생아 마우스에서 척수 뉴런을 분리하는 단계별 프로토콜에 대해 설명합니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 척수 적출

참고: 모든 기기는 멸균을 위해 고압멸균(135 x 30분 주기의 경우 4°C 및 7psi)해야 합니다.

1. 생후 1-3일 된 C57BL/6 새끼 쥐를 이소플루란이 있는 챔버에서 안락사시킵니다. 움직임이 멈춘 후 30초 동안 기다렸다가 다리를 꼬집어 반응이 없는지 확인합니다.
2. 강아지를 엎드린 자세로 가위를 사용하여 머리를 몸에서 분리합니다.
3. 뒷다리 또는 꼬리와 팔을 등쪽이 사용자를 향하도록 시술대에 고정합니다.
4. 구부러진 홍채 가위를 사용하여 피부를 잘라냅니다.
5. 엉덩이 바로 위의 요추 부위에서 척수를 자르고 흉부의 양쪽을 잘라 몸에서 분리합니다.
   메모: 이를 위해서는 다른 장기에 대한 부주의한 손상을 방지하기 위해 내장 기관에서 척수를 조심스럽게 절개해야 합니다(그림 1a).
6. 0.2μm 필터 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 5mL가 들어 있는 3 x 10cm 페트리 접시에 10초 동안 순차적으로 세척하여 과도한 조직을 제거합니다.
7. 여과 살균된 PBS 5mL로 채워진 22G 바늘과 주사기를 척추의 꼬리 끝에 삽입하고 두개골로 세척하여 탯줄이 네 번째 페트리 접시로 나오도록 합니다(그림 1b).
8. 얼음 위에 5mL의 HABG(표 1)가 있는 15mL 튜브에 척수를 수집합니다. 척수가 부러지지 않도록 주의하십시오.
9. 깔짚의 각 강아지에 대해 1.1–1.8단계를 반복합니다.
   메모: 이상적으로는 이 과정이 건강한 뉴런 격리를 보장하기 위해 척수당 30분 미만이 소요되어야 합니다.

2. 뉴런 분리

참고: 다음 단계는 층류 후드에서 수행해야 합니다. 기본 멸균 기술에 익숙해야 합니다.

1. 조직 다지기
   1. 척수가 들어있는 튜브를 잡고 가볍게 흔들어 조직을 매달아 놓습니다.
   2. 튜브의 조직을 60mm 유리 페트리 접시에 붓고 면도날로 깍둑썰기하여 ~0.5mm 크기의 미세한 조각을 만듭니다.
   3. 광구경 피펫이 있는 조직을 5mL의 HABG가 들어 있는 15mL 튜브로 옮깁니다.
   4. 세포가 이 온도에서 평형을 이룰 수 있도록 30°C 수조에 30분 동안 두십시오. fluid.
      에 부유할 수 있을 만큼만 셀을 셰이커에 유지합니다. 메모: 이 단계는 얼음에서 소화 매체로 이동할 때 세포에 충격을 주지 않기 위해 수행됩니다. 세포를 30°C로 유지하면 37°C에서 신진대사 증가와 관련된 세포 사멸을 줄이는 데 도움이 됩니다.
2. 소화 매체를 준비합니다(표 1).
3. 밀도 구배를 준비합니다(표 1).
   1. 표 1에 설명된 대로 4개의 개별 15mL 튜브에 4개의 각 층을 준비합니다.
   2. 각 레이어에서 1mL를 새 15mL 튜브에 추가합니다. 맨 아래에 있는 레이어 1부터 시작하여 맨 위에 있는 레이어 4에 도달할 때까지 순차적으로 추가합니다. 추가하는 동안 레이어를 방해하지 마십시오.
4. PDL 코팅 플레이트를 세척합니다. 멸균수로 몇 분 동안 씻은 후 남아 있는 물을 제거하고 1시간 동안 건조시킵니다.
5. 조직을 소화 매체로 옮깁니다.
   1. 30°C의 셰이커 수조에서 조직 함유 튜브를 제거하고 몇 분 동안 가라앉히십시오.
   2. 37°C 수조에서 소화 매체 튜브를 제거하고 류어 잠금 주사기로 흡입합니다.
   3. 조직 함유 튜브에서 과도한 HABG를 흡인합니다.
   4. 주사기에 leur-lock 0.2μm 필터를 사용하여 조직 함유 튜브에 소화 매체를 추가합니다.
   5. 튜브를 30°C 수조에 30분 동안 넣고 세포가 유체에 매달려 있을 수 있을 만큼만 세포를 흔듭니다.
      메모: 세포를 소화 매체에 너무 오래 보관하거나 온도를 너무 높게 유지하여 과도한 소화로 이어져 조직이 젤라틴 혼합물에 부유하게 될 수 없도록 하는 것이 중요합니다.
6. 이 기간 동안 라미닌을 코팅하십시오.
7. trituration(즉, 조직에서 세포 분리)을 수행합니다.
   1. 흔들리는 30°C 수조에서 튜브를 제거하고 몇 분 동안 가라앉히십시오.
   2. 과도한 소화 매체를 흡입하십시오.
   3. 2mL의 HABG에 조직을 현탁시킵니다.
   4. 내경이 좁은 피펫을 사용하여 45초 동안 10배 분쇄합니다.
      메모: 이것은 아마도 가장 중요한 단일 단계일 것이며 제대로 수행하지 않으면 수확량을 크게 줄일 수 있습니다.
      1. 조직을 피펫에 흡입하고 즉시 내용물을 다시 비웁니다.
      2. 공기를 주입하면 실행 가능한 수율이 크게 감소하므로 공기를 주입하지 마십시오.
         메모: 이상적인 피펫은 9인치 유리 피펫입니다. 피펫의 끝은 거친 표면을 매끄럽게 하기 위해 화염 연마되어야 합니다. 그런 다음 클로로포름 및 왼쪽 O/N의 디클로로디메틸실란(DMDCS)의 1:20 용액에 배치하여 실리콘화해야 합니다. 그런 다음 피펫을 제거하고 자연 건조시켜야 합니다. 그 후, 살균을 위해 오토클레이브해야 합니다.
         주의: DMDCS와 클로로포름은 가연성이 높으므로 실리콘화는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
   5. 상층액의 상단 2mL를 흡인하고 "collection"이라고 표시된 새 15mL 튜브에 넣습니다.
   6. 2.7.3–2.7.5단계를 두 번 더 반복합니다(세포 채취 튜브의 마지막에는 6mL가 있어야 함).
   7. 수집 튜브 내용물을 2.2단계에서 준비한 구배 튜브로 천천히 옮겨 구배가 중단되지 않도록 합니다.
8. 이 시점에서 미리 준비된 neurobasal 배지(표 1)를 냉장고에서 꺼내 37°C 수조에서 데웁니다.
9. 뉴런을 정화합니다.
   1. 그라디언트 튜브를 800 x g 및 22 °C에서 15분 동안 원심분리합니다.
   2. 피펫으로 원하는 층을 모으고(그림 2) 새 15mL 튜브에 넣습니다. 최고 순도의 뉴런 분리(즉, >90%)를 위해 레이어 3을 수집합니다. 더 적은 순도(즉, >70–80%)로 더 많은 수율을 얻으려면 레이어 2 및 3을 수집하십시오.
   3. 새로 수집된 층에 5mL의 HABG를 추가하여 밀도 구배를 희석합니다.
   4. 200 x g에서 22°C에서 2분간 원심분리기.
   5. 상등액을 버리고 5mL의 HABG에 재현탁한 다음 펠릿을 튕겨 세포를 현탁시킵니다.
   6. 200 x g에서 22°C에서 2분간 원심분리기.
   7. 상층액을 버리고 3mL의 neurobasal 배지에 재현탁한 다음 펠릿을 튕겨 세포를 재현탁합니다.

주 트 개

미디어	보관	성분			준비
HABG	4 °C/24h		100 mL		- B27을 4 °C 냉장고에서 해동, O/N - 필터 살균 (0.22 μm)
최대 절전 모드 A	97.8 mL
나27호 [2%]	2 mL
글루타맥스[0.5mM]	0.25 mL
Neurobasal 배지	4 °C/1		100 mL		- B27을 4°C 냉장고에서 해동 - 필터 살균 (0.22 μm) - 50mL 분량을 50mL 튜브에 부분 표본(4°C 보관)
		신경기저 A	97 mL
		나27호 [2%]	2 mL
		글루타맥스[0.5mM]	0.25 mL
		펜/연쇄상구균 [1%]	1 mL
소화 매체	격리의 날		10 mL		- 격렬하게 흔듭니다 - 37°C 욕조에 30분 동안 그대로 두십시오(이상적으로는 사용 30분 전에 준비) - 필터 살균 (0.22 μm)
		하-Ca	10 mL
		파파인	25 mg
		글루타맥스[0.5mM]	0.025 mL
밀도 그라디언	격리의 날		1 그라디언트
		레이어	옵티프렙	합그
			(0.13 밀리리터)	(5.29 밀리리터)
		1 바닥	0.26 밀리리터	1.24 밀리리터
		2	0.19 밀리리터	1.31 밀리리터
		3	0.15 밀리리터	1.35 밀리리터
		4 상의	0.11 밀리리터	1.39 밀리리터

표 1: 이 프로토콜에 사용되는 미디어 및 솔루션 준비.

Results

그림 1: 생후 3일 된 신생아 마우스에서 척추 절개 및 척수 방출. (a)의 화살표는 척추의 꼬리 끝을 가리키며, 여기서 바늘을 삽입하여 척수를 풀어줍니다. 방출된 척수(b)는 PBS에 잠긴 것으로 표시됩니다.

그림 2: 밀도 구배, 원심분리 후 세포가 추가된 경우. 레이어는 윤곽이 그려지고 만화 묘사에서 더 잘 시각화됩니다. 가장 표면적인 층(0)은 일반적으로 척수 조...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
최대 절전 모드 A 배지 - 500 mL	써모 피셔	A1247501	https://www.thermofisher.com/ 주문/카탈로그/제품/A1247501
동면 A 마이너스 칼슘 - 500 mL	브레인비트	하-Ca	http://www.brainbitsllc.com/ 최대 절전 모드 -a-마이너스-칼슘/
글루타맥스 100X - 100 mL	써모 피셔	35050061	https://www.thermofisher.com/ 주문/카탈로그/제품/35050079
B27 보충제 50X - 10 mL	써모 피셔	17504044	https://www.thermofisher.com/ 주문/카탈로그/제품/17504044
파파인, 동결건조 - 100 mg	워 딩 턴	LS003119	http://www.worthington- biochem.com/pap/cat.html
Neurobasal A 배지 - 500 mL	써모 피셔	10888022	https://www.thermofisher.com/ 주문/카탈로그/제품/10888022
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	써모 피셔	15140122	https://www.thermofisher.com/ 주문/카탈로그/제품/15140122
폴리-D-라이신(PDL) 하이드로브롬화물 - 5mg	시그마-알드리치	P6407-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/p6407? lang=en®ion=US
마우스 라미닌 - 1 mg	써모 피셔	23017015	https://www.thermofisher.com/ 주문/카탈로그/제품/23017015
트리판 블루 - 20 mL	시그마-알드리치	T8154-20ML	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/t8154? lang=en®ion=US
OptiPrep 밀도 그라디언트 미디엄-250mL	시그마-알드리치	D1556-250ML	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/d1556? lang=en®ion=US
디클로로디메틸실란(DMDCS, 시그마 실리코트)	시그마-알드리치	440272-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/440272? lang=en®ion=US
클로로포름	시그마-알드리치	288306-1L	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sial/288306? lang=en®ion=US
유리 피펫 - 9"	시그마-알드리치	13-678-20씨	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/cls7095d9? lang=en®ion=US
피펫 벌브 - 5 mL	시그마-알드리치	Z186678-3개	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/z186678? lang=ko®ion=US&cm_sp=Insite- _-prodRecCold_xviews-_- prodRecCold10-1
BRAND® 페트리 접시, 유리 - 60 x 15 mm	시그마-알드리치	BR455717-10개	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/aldrich/br455717? lang=en®ion=US
멸균 24웰 세포 배양 플레이트	시그마-알드리치	M8812-100개	http://www.sigmaaldrich.com/ catalog/product/sigma/m8812? lang=en®ion=US