심폐 복합체 탈세포화: 쥐 모델에서 심장 및 폐를 탈세포화하는 기술

Abstract

출처: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. 쥐 심폐 복합체의 탈세포화. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오는 혈관 구조를 통해 세제의 사전 관류를 적용하여 탈세포화된 세포외 기질 또는 ECM 골격을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 구조적 ECM 스캐폴드를 사용하여 심폐 질환과 관련된 ECM 리모델링을 분석할 수 있습니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 사후 미세수술

1. CO₂ 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
   1. 마우스를 4L 챔버에 넣고 100% CO₂로 채우기 시작하며, 0.2L/분에서 2분 동안 시작하여 3분 후 0.8L/분의 흐름에 도달할 때까지 증가시킵니다. 마우스는 처음 2분 동안 의식을 잃고 호흡이 멈춰야 합니다(보통 약 5분, 그러나 필요에 따라 흐름을 유지할 수 있습니다). 다음 단계를 진행하기 전에 사망을 확인하십시오.
2. 이발기로 마우스의 흉부, 복부, 등을 면도하고 70% 에탄올로 소독합니다. 면도는 이미징 또는 생화학 분석을 위한 샘플에 머리카락이 존재하기 때문에 인공물의 수를 크게 줄입니다.
3. 마우스를 폴리스티렌 트레이에 고정하고 앞다리와 뒷다리, 머리와 꼬리를 확장합니다. 현미경 현미경 아래에 놓습니다.
4. Mayo 직선 패턴 가위를 사용하여 턱밑 부위에서 하복부까지 이어지는 피부 절개로 외과적 접근을 확립하고 피하를 절개하여 흉벽과 복막을 노출시킵니다.
5. 미세수술 가위를 사용하여 흉벽 양쪽의 여섯 번째 늑간 공간을 따라 대흉근과 대흉근 소근육을 자릅니다.
6. 직선 패턴 가위를 사용하여 이전 절개 부위를 따라 흉골을 자른 다음 긴 축을 따라 흉골을 절단하여 흉골 절개술을 완료한 다음 흉벽 양쪽을 들어 올려 고정하여 심폐 복합체를 노출시킵니다.
7. 끝이 둥근 미세겸자(또는 Dumont 미세집게)를 사용하여 흉선과 주변 지방 조직을 부착물에서 섬세하게 잡아당겨 절제합니다. 그러면 주요 선박이 드러납니다.
8. 소작을 사용하여 하강하는 강낭 정맥을 소작하고 직선 패턴 가위를 사용하여 식도를 자릅니다.
9. 날카로운 마이크로 겸자를 사용하여 상완두정맥과 상완두정맥, 좌측 총경동맥 및 좌측 쇄골하 동맥을 하부 조직에서 분리하여 결찰 및 소작을 용이하게 합니다.
10. 마이크로 바늘 홀더를 사용하여 날카로운 마이크로 집게와 9-0 봉합사를 사용하여 상완 동맥, 좌측 일반 경동맥 및 좌측 쇄골하 동맥의 출현 위에 스티치를 배치합니다.
11. 상완두정맥을 소작합니다.
12. 정중선을 따라 턱밑 타액선을 분리하여 목 근육과 기관을 노출시킵니다. 근육을 분리하여 갑상선 인대를 노출시킵니다. 마이크로 가위를 사용하여 인대를 절편하여 입구를 엽니다.
13. 기관에 27G 카테터를 삽입하고 기관이 기관지로 분기할 때까지(즉, 카테터에 대한 저항이 충족될 때까지 3mm 후퇴할 때까지) 섬세하게 밀어 넣습니다. 기관지를 방해하지 않도록 주의하세요. 6-0 봉합사를 사용하여 기관 주위에 3바늘을 꿰매어 카테터를 고정합니다.
14. 12번째 흉추 높이에서 마우스를 절단합니다. 하행 대동맥은 척추 앞쪽으로 뻗어 있으며 척추와 함께 여기에서 절단되어야 합니다. 아래쪽 절반을 떨어뜨립니다.
역
15. 행성으로 대동맥 카테터를 삽입하고 대동맥호에 도달할 때까지 카테터를 밀어 넣습니다. 9-0 봉합사를 사용하여 카테터 팁 아래 5mm에서 시작하여 대동맥 주위에 4바늘을 꿰맸습니다.

2. 탈세포화

1. 실리콘 튜브와 Luer 커넥터를 사용하여 마우스를 펌프 시스템에 연결합니다. 200μL/min에서 15분 동안 탈이온수로 관류합니다. 탈세포화하는 동안 이 유속을 유지하십시오.
2. 관류제를 탈이온수에 희석한 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(DOC)로 변경하고 밤새 관류합니다.
3. 관류제를 탈이온수에 희석한 0.1% 도데실황산나트륨(SDS)으로 변경하고 8시간 동안 관류합니다.
4. 밤새 탈이온수를 관류하여 24시간 동안 SDS 및 DOC를 씻어냅니다.
5. 구부러진 가위를 사용하여 흉부에 대한 부착물을 절단하여 탈세포화된 심장과 폐를 절제하고 4°C에서 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신과 0.3μM 아지드화나트륨이 함유된 탈이온수가 있는 멸균 극저온 튜브에 보관합니다.ECM 골격은 최소 12주 동안 보관할 수 있습니다. 스캐폴드가 생화학적 분석(예: 질량 분석법)에 사용되는 경우 액체 질소에서 스냅 동결합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
미세수술
6-0 봉합사, 삼각절삭(Vicryl)	에티콘	6301124
9-0 마이크로 봉합사(사필)	B 브라운	G1048611
애드슨 겸자	정밀 과학 도구	11006-12
이빨이 있는 Adson 겸자	정밀 과학 도구	11027-12
Castroviejo 마이크로니들 홀더	정밀 과학 도구	12061-01
마우스 안락사를 위한 CO2 환기 챔버
탈이온수(Milli-Q IQ 7000, 초순수 실험실 용수 시스템)	머 크	ZIQ7000T0
일회용 폴리스티렌 트레이 (~ 30 × 50cm)
해부 현미경 (Greenough, 두 팔 구즈넥 포함)	라이카	시즌 6 D
양단 마이크로스패츌라	정밀 과학 도구	10091-12
Dumont 마이크로 집게(2개)	정밀 과학 도구	11252-20
Dumont 마이크로펜셉스(팁 45°)	정밀 과학 도구	11251-35
이발기	오스터	76998-320-051
Halsey 바늘 홀더(텅스텐 카바이드 죠 포함)	정밀 과학 도구	12500-12
정맥 주사 24게이지 카테터(Insyte)	BD (영어)	381512
26게이지 카테터 정맥 주사(Terumo)	서플로-W	SR+DM2619WX
메이요 가위(터프 컷, 스트레이트)	정밀 과학 도구	14110-15
끝이 고리 모양인 마이크로핀셋	에스큘랍	FM571R
마이크로 스프링 가위(Vannas, 곡선형)	정밀 과학 도구	15001-08
바늘(27 게이지; 마이크로랜스)	BD (영어)	21018
종이 타월(멸균) 또는 수술용 냅킨
톱니 가위(CeramaCut, 스트레이트)	정밀 과학 도구	14958-09
주걱 (Freer-Yasargil)	에스큘랍	OL166R
주사기(1mL; 플라스티팍)	BD (영어)	3021001
주사기(10mL; 플라스티팍)	BD (영어)	3021110
힘줄 가위 (Walton)	정밀 과학 도구	14077-09
탈세포화(DECELLULARIZATION)
70% 에탄올(절대 알코올 99.9%); 절대 알코올은 탈이온수를 사용하여 70%(vol/vol)로 조정해야 합니다	자두	1680766
탈이온수(Milli-Q IQ 7000, 초순수 실험실 용수 시스템)	머 크	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing 수 피팅 (1/8 인치)	세계적인 정밀 기기	13158-100
Luer-to-tubing 수 피팅 (1/8 인치)	세계적인 정밀 기기	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	70011044
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122
연동 펌프(12개 채널 포함)	올레 디치	110AC(R)20G75
실리콘 튜브(2mm 내경 및 4mm 외경 포함)	올레 디치	31399
아지드화나트륨	시그마-알드리치	08591-1ML-F
소듐데옥시콜레이트(DOC)	시그마-알드리치	D6750-100G