마우스 모델에서 CVP(Circumvallate Papillae) 상피의 분리: 마우스 혀에서 CVP 상피를 분리하는 효소 절차

초록

출처: Shechtman, L. A. et al. 성체 마우스 미각 줄기 세포에서 유래한 언어 오가노이드의 생성 및 배양. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 쥐 혀에서 CVP(circumvallate papillae) 상피를 분리하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. CVP 상피의 분리

1. IACUC 규정에 따라 CO₂ 질식으로 마우스를 안락사시킨 후 양측 개흉술, 자궁경부 탈구, 참수 또는 출혈과 같은 승인된 2차 방법을 시행합니다.
2. 큰 멸균 해부 가위를 사용하여 뺨을 자르고 턱을 부러뜨립니다. 혀를 들어 올리고 설측을 잘라 구강 바닥에서 혀를 분리합니다. 혀를 잘라내어 Ca²⁺ 및 Mg^{2+와 함께 멸균된 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS)에 수집합니다}.
3. 면도날로 소구치 돌출부의 바로 앞쪽을 절단하여 앞쪽 혀를 제거하고 버립니다(그림 1A, 점선). 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 혀뒤쪽에서 머리카락과 과도한 액체를 제거합니다.
4. 1mL 주사기에 200–300μL의 주입 효소 용액(최종 농도: 2mg/mL type-I 콜라겐분해효소 및 5mg/mL Dispase II(Ca²⁺/Mg^10mg/mL 원액에서 희석된 2+ 함유 dPBS)을 채우고 소구치 돌출부 바로 위에 30G x 1/2 바늘을 삽입합니다(그림 1B, 검은색 화살표)를 CVP 바로 앞까지 표시합니다(그림 1B, 검은색 상자). 효소 용액을 상피와 기저 조직(lamina propria, muscle) 사이의 CVP 아래 및 측면 가장자리에 주입합니다. 주사가 수행되는 동안 혀에서 주사기를 천천히 지속적으로 빼냅니다.
5. 멸균 Ca²⁺/Mg²⁺-free dPBS에서 정확히 33분 동안 혀를 배양합니다.
6. 매우 미세한 해부 가위를 사용하여 상피를 양측으로 그리고 CVP 바로 앞쪽에 작게 자르고 가는 집게로 상피를 들어 올려 상피를 부드럽게 벗깁니다. 트렌치 상피에 기본 결합 조직이 제거되면 FBS가 사전 코팅된 빈 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. CVP 상피를 분리하기 전이나 후에 상피 트리밍을 수행합니다(그림 1C, D).

결과

그림 1: 절개된 혀와 벗겨진 CVP 상피. (A) 혀를 절개하고, 소구치(intermolar eminence)의 바로 앞(점선)을 절단하여 CVP(블랙박스)를 포함하는 후방혀(posterior tongue)를 남겨두고, (B) 소구치(intermolar eminence) 바로 앞에 바늘을 삽입하고(검은색 화살표), CVP의 측면 가장자리(블랙박스) 아래에 효소 혼합물을 주입합니다. (C) CVP 트렌치를 둘러싼 트리밍되지 않은 벗겨진 상피(검은색 화살표) 및 (D) 트리밍된 벗겨진 CVP 상피. 폰 에브너의 땀샘과 관(D, 검은색 화살표)은 참호를 성공적으로 벗겨낸 후 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL TB 주사기	BD 주사기	309659
Dulbecco의 Ca²⁺ & Mg²⁺를 함유한 인산염 완충 식염수	지브코	제10010-023
Dulbecco의 Ca²⁺ & Mg²⁺를 함유한 인산염 완충 식염수	시그마 생명과학	D8662-500ML
Dumont #5 집게	정밀 과학 도구	11252-30
소 태아 세럼(FBS)	지브코	제26140-079
1mL TB 주사기	BD 주사기	309659
2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브	미국 과학	1420-2700
수술 용 가위-샤프	정밀 과학 도구	14002-14
엑스트라 파인 본 가위	정밀 과학 도구	14084-08
빅 디지트 타이머/스톱워치	피셔 사이언티픽	S407992
실체현미경	자이스	스테미 SV6
Cohan-Vannas 봄 가위	정밀 과학 도구	15000-02
클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)의 콜라겐분해효소, I형	시그마 생명과학	C0130-1지
Dispase II(중성 프로테아제, 등급 II)	시그마-알드리치(로슈)	4942078001

호 년 호 년 년 년 년