고립된 쥐 배아에 microbubbles의 주입: 살아있는 쥐 배아의 혈관 구조로 microbubble 조영제를 전달하는 기술

Abstract

출처: Denbeigh, J. M. et al. 고주파 초음파를 사용한 마우스 배아의 조영제 이미징. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 격리된 임신 후기 마우스 배아에 마이크로버블 조영제를 주입하는 절차를 보여줍니다. 마이크로버블 조영제 기반 초음파 영상은 배아의 혈관 환경을 시각화하고 특성화하는 데 도움이 됩니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마이크로 버블 준비

1. 주입을 위한 microbubbles 준비
   메모: 보조자는 '배아에 마이크로버블(MB) 주입'이 시작될 때 이 단계를 수행합니다. 각 배아는 각 주입을 위해 선택된 마이크로 버블의 유형이 한 번 주입되며, 모든 유형의 마이크로 버블이 절차 전체에 고르게 분포되지만 임의의 순서로 주어지도록 조수에 의해 무작위로 선택됩니다. 외과의가 주입되는 거품의 유형을 알지 못하는지 확인하십시오.
   1. 400μL의 부피에서 1 x 10^8MB/mL의 최종 농도를 생성하는 데 필요한 스톡 버블 용액의 부피를 측정합니다(스톡 농도를 사용하여 부피 계산). 해당 부피의 식염수를 빈 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다.
   2. 선택한 마이크로버블 바이알을 부드럽게 교반하고 21G 바늘을 사용하여 1mL 주사기에 초과량(위에서 계산한 것보다 ~50μL 큼)을 추출합니다. 빈 미세 원심분리기 튜브에 미세 기포를 주입합니다.
   3. 필요한 양의 microbubble stock solution을 피펫으로 넣고 식염수의 부분 표본에 추가합니다. 피펫 끝으로 부드럽게 저어주어 섞습니다.
   4. 21G 바늘을 사용하여 희석된 마이크로 버블 용액을 깨끗한 주사기에 끌어들입니다. 바늘을 제거하고 주사기에서 기포를 제거하고 루어와 튜브를 부착합니다. 기포가 발생하지 않도록 용액을 튜브 끝까지 천천히 밀어 넣습니다.
   주
   5. 사기를 주입 펌프 세트에 삽입하여 총 20μL의 부피에 대해 20μL/분의 속도로 미세 기포를 분배합니다. 당긴 유리 바늘을 튜브 끝에 부착합니다. 펌프를 사출 단계 가까이로 이동합니다.

2. 배아에 마이크로버블 주입

1. 무작위로 선택하여 (구멍이 뚫린 숟가락 사용으로) 냉장 배지 접시에서 배아 하나를 제거합니다. 입체경 아래의 초음파 스테이지에 위치한 해부 접시에 놓고 미세한 집게로 난황낭과 양막을 제거하고 혈관이 가장 적게 있는 쪽(무시간체 쪽)을 자르거나 찢습니다. 이것은 머리 영역에 인접한 영역을 뚫는 것이 가장 쉽습니다.
   1. 내부에서 배아를 제거할 수 있을 만큼 충분히 자르되 더 이상은 안 됩니다. 작은 플라스틱 조각을 사용하여 해부 접시를 안정화합니다.
2. 배아 주위에서 주머니를 부드럽게 움직입니다. 배아를 옆으로 눕히고 태반과 배꼽 혈관을 앞에 놓습니다. 곤충 핀을 사용하여 난황낭(4핀 권장)과 태반의 가장자리를 핀으로 고정하여 필요에 따라 제자리에 고정합니다. 주요 선박을 피하십시오.
3. 배아가 살아날 때까지 예열된 45°C PBS로 배아를 세척합니다. 제대 정맥 및 관련 혈관 네트워크를 확인합니다. 주입이 편안하게 이루어질 수 있도록 접시를 배치하십시오.
   메모: 일단 따뜻해지면 배아의 혈액이 흐르기 시작하여 눈에 띄게 탯줄 동맥에서 펌핑됩니다. 혈류가 처음 시작되면 정맥은 밝은 빨간색이 되고 두 혈관의 혈액이 빠르게 동일하게 나타납니다. 탯줄정맥에서 발생하는 가지는 일반적으로 태반 표면의 탯줄 동맥에서 나온 가지와 겹쳐
져 있습니다.
4. 배아가 되살아나면 배아를 미리 데운 US 젤로 덮고(태반은 아님) 배아 주변의 기포(가는 집게 사용)를 섬세하게 제거합니다. 예열된 PBS를 접시에 얹습니다.
   메모: PBS 및 젤 주사기의 용액 수준을 주시하고 필요에 따라 가열 비커에 백업 주사기를 추가합니다.
5. 해부 접시 가장자리에 있는 큰 플라스틱 볼에 유리 바늘을 장착하고 바늘 끝을 PBS에 삽입합니다. 태반 디스크의 융모막 표면에있는 정맥을 선택하고 주요 분기에서 합리적인 거리까지 가위를 사용하여 팁을 크기에 맞게 자릅니다. 팁이 약간의 각도로 절단되면 주입이 가장 쉽습니다. 스프링 가위의 가장자리를 사용하여 유리의 들쭉날쭉한 가장자리를 제거합니다.
6. 주사기 펌프를 사용하여 모든 공기가 바늘 끝에서 배출되고 미세 기포가 PBS로 자유롭게 흐르는 것을 볼 수 있을 때까지 유리 바늘에 20μL/분의 속도로 미세 기포 용액을 천천히 주입합니다. 펌프를 중지하고 주입량을 20μL로 재설정합니다. 주입하는 동안 배아의 혈관계로 공기가 들어가지 않도록 하십시오.
7. 유리 바늘 끝을 태반의 정맥 중 하나에 부드럽게 삽입하고 움직이지 않는지 확인합니다. 스테레오스코프 헤드를 휘둘러 치우고 트랜스듀서를 배아 위에 놓습니다. 이미징을 시작합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
얼음
0.9% 염화나트륨(식염수)	호스피라	TEL.0409-7984-11
인산염 완충 식염수 [1x]	시그마	D8537	1x, 염화칼슘 & 염화마그네슘 없음
초음파 조영제, 표적 준비 및 비표적	마이크로마커; 비주얼소닉스 Inc.
초음파 젤 (Aquasonic 100, 무색)	CSP 의료	133-1009
얼음 양동이	콜 파머	RK 06274-01
이미징 플랫폼	비주얼소닉스 Inc.	통합 철도 시스템
광원, 광섬유	피셔 사이언티픽	Tel.: 12-562-36	이상적으로는 조정 가능한 팔이 있습니다.
루어(12), 폴리프로필렌 가시 암 1/4-28 UNF 나사	콜 파머	45500-30
마이크로 초음파 시스템, 고주파	비주얼소닉스 Inc.	베보2100
바늘, 21 게이지(1")	폭스바겐	305165
천공 숟가락 (Moria)	정밀 과학 도구	엠씨 17 10373-17
핀(6), 검은색 알루마이트 처리 minutien 0.15mm	정밀 과학 도구	26002-15
주사기, 1 mL Normject	어부	Tel.: 14-817-25
주사기 주입 펌프	바이오 살쾡이	재질 보기 NE-1000
피펫터 [2-20 μL, 20-200 μL, 100-1,000 μL]	에펜도르프	리서치 플러스 조절 가능 3120000038; 3120000054; 3120000062
피펫터 팁 [2-200 μL, 50-1,000 μL]	에펜도르프	epT.I.P.S. 22491334; 022491351
가위
유리 모세관, 1 x 90 mm GD-1 (필라멘트 포함	나리시게	GD-1
유리 바늘 풀러	나리시게	PN-30
튜브, Eppendorf	폭스바겐	20170-577
튜브 랙 (3)	폭스바겐	82024-462
핫 플레이트	폭스바겐	89090-994
주사기(10개), 30mL	폭스바겐	CA64000-041
초음파 변환기, 20MHz	비주얼소닉스 Inc.	MS250 (영문