면봉 기반 결막 공생 박테리아 분리: 쥐 모델의 결막에서 공생 박테리아를 분리하는 기술

초록

출처: Smith-Page, K. et al. 쥐의 결막 공생 분리 및 식별. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오는 안구 결막에서 생존 가능한 공생 박테리아를 분리하는 면봉 기반 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 병원체에 대한 방어 역할을 하는 결막의 공생 박테리아 마이크로바이옴을 프로파일링하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 눈 면봉 준비, 작업 현장 설정, 마우스 눈 면봉 및 샘플 농축

1. 멸균 눈 면봉 준비
   메모: 멸균 눈 면봉은 섬유, 얇은 면 안솜 층으로 얇게 코팅 된 나무 이쑤시개이며 집에서 만듭니다.
   1. 면봉으로 닦을 쥐의 수에 대해 적절한 양의 면 안솜과 이쑤시개를 오토클레이브합니다.
   2. 반 센티미터 길이의 솜 반죽을 엄지와 검지로 집어냅니다. 엄지와 검지로 가장자리를 당겨 평평한 단일 다공성 층을 형성하고 안솜이 무너지기 직전에 멈춥니다(늘어난 안솜 전체에 흩어져 있는 작은 면 조각은 허용됨).
   이
   3. 쑤시개 끝에 뻗은 부분을 꼬일 때 가볍게 잡고 이쑤시개의 날카로운 끝 부분 중 하나 주위를 배팅을 휘젓습니다(그림 1 참조). "완성된" 안면봉은 끝에서 약 1/2에서 1cm 떨어진 곳에 매우 얇은 면봉 층이 뻗어 있습니다.
   4. "완성된" 면봉을 작은 비커에 삽입하고 면봉 면이 아래를 향하게 하여 덮습니다. 오토 클레이 브.
2. 작업 공간 설정
   1. 멸균 50mL 멸균 원심분리 튜브에 케타민 2mL(100mg/mL), 자일라진 400μL(100mg/mL) 및 멸균 식염수 27.6mL(dH₂O 중 0.9% NaCl)가 포함된 마취를 준비합니다. 즉시 사용할 수 있도록 필터 멸균 및 부분 표본 마취(4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있음, 사용하기 전에 항상 실온과 평형을 이룰 수 있음).
   2. 오염을 최소화하기 위해 소독제로 작업 영역을 청소하고 청소하십시오.
   3. 0.5mL의 멸균 뇌 심장 주입 매체(BHI)를 라벨이 부착된 1.5mL 멸균 마이크로 원심분리기 튜브(마우스 및 대조군당 튜브 1개)에 분취합니다. 마이크로 원심분리기 랙에 정렬합니다. 랙을 얼음 위에 놓습니다.
   4. 작업 흐름을 다음과 같이 설정합니다(왼쪽에서 오른쪽으로): 마우스 마취 스테이션(실험용 마우스가 들어 있는 케이지, 빈 멸균 케이지, 실온 마취, 25G 바늘 및 1mL 주사기), 눈 면봉 스테이션(얼음에 분취된 BHI, 멸균된 눈 면봉, 깨끗한 종이 타월, 70% 이소프로판올 스프레이) 및 도금 스테이션(실온 혈액 한천 플레이트, 10μL 피펫, 10 μL 멸균 일회용 팁, 생물학적 위험 폐기물 용기).
3. 눈 면봉
   1. 각 성인 마우스에게 체중 1g당 10μL의 마취를 투여하고 케타민과 자일라진을 각각 복강내로 투여하고 오토클레이브 케이지에 넣습니다. 뒷발 패드를 짜서 마취를 시험하십시오. 움직임이 없으면 적절한 마취가 이루어졌음을 나타냅니다.
   2. 한 손은 마취된 마우스만 다루도록 할당하고 다른 손은 면봉과 배양물만 처리하도록 지정합니다. 면봉을 위해 케이지에서 완전히 마취된 마우스를 제거합니다. 왼쪽 눈이 노출되도록 측면에 위치한 깨끗한 작업 표면 위에 놓습니다. 장갑을 낀 손에 이소프로판올을 뿌리고 깨끗한 종이 타월로 말리십시오.
   3. 전용 매체 취급 핸드가 있는 특수 라벨이 부착된 BHI 마이크로 원심분리기 튜브의 뚜껑을 해제합니다. 튜브를 얼음 위의 마이크로 원심분리기 랙에 다시 놓습니다. 면봉의 면봉 끝을 BHI에 담그고 튜브에서 안면봉을 빼내고 팁을 내부 튜브에 대고 2회 소용돌이쳐 과도한 액체를 제거합니다.
   4. 마우스를 다루는 손으로 마우스의 목덜미를 부드럽게 잡습니다. 다른 손으로 면봉 끝을 왼쪽 눈의 내측 결막 부위에 대십시오(그림 2A 참조). 안구를 가볍게 누르고 면봉을 창 세척 동작(그림 2B)으로 아래쪽 눈꺼풀과 눈 사이를 앞뒤로 10회 움직입니다. 일정한 압력을 유지하십시오.
   5. 털을 만지지 않고 면봉이 삽입된 위치에 수직으로 면봉 끝을 부드럽게 제거하고 면봉 면봉 면을 아래로 향하게 하여 BHI 매체가 들어 있는 라벨이 붙은 마이크로 원심분리기 튜브에 직접 넣습니다. 면봉으로 닦은 눈에 윤활 점안액을 바릅니다.
   6. 마우스를 케이지로 되돌립니다.
   7. 면봉을 얼음 위에 10-15분 동안 그대로 두었다가 멸균된 장갑을 낀 손으로 팁을 미디어에 10회 섞어 면봉을 제거합니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 내벽에 팁을 소용돌이치며 5회 회전하여 면봉을 빼냅니다. 면봉은 생물학적 위험 용기에 폐기하십시오.
   8. 각 마우스와 대조군 샘플(피부 또는 털 면봉)에 대해 1.3.2-1.3.7단계를 반복합니다. 각 면봉 사이에 장갑을 적절하게 소독하십시오.
4. 농축
   1. 37°C에서 1시간 동안 튜브를 정적으로 배양하여 샘플을 농축합니다.
   2. 배양 중에는 생쥐 한 마리당 5% 양의 혈액 한천 플레이트(TSA 플레이트)를 실온의 트립티카제 소이 1개에 표시하고 반으로 나눕니다.
   3. 안면 채취 배양 후 인큐베이터에서 농축 샘플을 제거하고 얼음 위에 놓습니다.
   4. 간단히 와류 샘플은 그림 3A의 회로도에 따라 혼합하고 플레이팅합니다. 샘플의 10μL를 TSA 플레이트에 분취하고 플레이트를 기울여 스트립을 형성하고 2회 반복합니다.
   5. 플레이트의 구분선의 반대쪽에서 한천에 샘플 10μL를 점으로 찍고 9회 반복합니다.
   6. 37 ° C에서 18 시간, 2 일 및 4 일 동안 플레이트를 배양합니다 (한천 플레이트가 건조되는 것을 방지하는 깨끗한 챔버에서). 스트립의 군체를 세고, 형태학을 기록하고, 형태학적으로 유사한 분리물에 대해 면봉당 집락 형성 단위(CFU)를 계산합니다. 스트립에 포착되지 않은 고유한 유기체에 대한 점을 확인합니다.

결과

그림 1: 사내 안구 면봉.
(A) 약 1cm의 얇은 뽑힌 면 안솜 조각을 멸균 이쑤시개 끝과 검지 손가락 사이에 놓고 솜이 이쑤시개 끝에 완전히 말릴 때까지 집게 손가락에 약간의 압력을 유지하면서 이쑤시개를 굴렸습니다. (B) 안구 면봉의 예.

그림 2: 쥐 결막 안면 면봉 위치.
(A) BHI 젖은...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.1 - 10 μL 피펫 팁	미국 과학	1110-300	사용 전 오토클레이브
0.5 - 10 μl Eppendorf 피펫	피셔 사이언티픽	Tel.: 13-690-026
주사기 1ml	피셔 사이언티픽	BD309623	각 안구 면봉 그룹당 주사기 1
1.5 ml Eppendorf 튜브	미국 과학	1615-5500	사용 전 오토클레이브
1000 μ ml 피펫 팁	미국 과학	1111-2021	사용 전 오토클레이브
200 - 1000 μl Gilson 피펫맨(P1000)	피셔 사이언티픽	F123602G
바늘 25G	피셔 사이언티픽	14-826AA	눈 면봉 그룹당 1개의 바늘
3% 과산화수소	피셔 사이언티픽	S25359
37 ° C 인큐베이터	실험실 장비
70 % 이소프로판올	피셔 사이언티픽	PX1840-4
Ana-Sed 주사 (자일라진 100 mg/ml)	산타 크루즈 동물 건강	사우스 캐롤라이나-362949Rx
분젠 버너	실험실 장비
깨끗한 종이 타월	실험실 장비
코튼 안솜/멸균 압연 코튼	증권 시세
케타민 (100 mg/ml)	헨리 샤인	9950001
마우스	잭슨 연구소	C57/BL6J
페트리 접시	피셔 사이언티픽	08-757-12	Mannitol Salt 한천 플레이트의 경우
RPI 뇌 심장 주입 미디어	피셔 사이언티픽	50-488525	지시 및 오토클레이브에 따라 준비
SteriFlip (0.22 μm 기공 크기 폴리에스터 설폰)	EMD/Millipore, 피셔 Scientifc	SCGP00525	마취를 살균하기 위해
멸균 마우스 케이지	실험실 장비
이쑤시개 (둥근 대나무)	주방 필수품		사용 전 오토클레이브 및 면봉 준비
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates (트립티카제 소이 한천 II 5% 함유	피셔 사이언티픽	4321261	사용할 준비가 될 때까지 4°C에서 보관하십시오
일회용 안약	CVS 약국		Bausch and Lomb 수드 루브리컨트 점안액, 28 바이알, 각 0.02 fl oz.

년 개 년 년 시리즈 표시기 ) .