다광자 현미경 기반 혈관 시각화를 위한 이미징 픽스처 지원 마우스 간 스테이징: 마우스 간 혈관의 다차원 이미지를 얻기 위한 안정화 장치 보조 이미징 기술

초록

출처: Rongrong, W. et al. 마우스 간 조직의 혈관에 대한 다광자 현미경 관찰. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오는 장기의 안정화 후 다광자 현미경을 사용하여 마우스 간 조직의 혈관 내 역학을 관찰하고 연구하는 이미징 절차를 설명합니다. 다광자 현미경 검사는 생체 내에서 높은 공간 해상도로 생물학적 조직을 이미징할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 준비

1. 마우스 마취
   1. 주사기에 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)을 준비합니다.
   2. 쥐(8주 된 수컷 C57BL/6)를 왼손으로 잡고 배가 위를 향하고 머리가 꼬리보다 낮도록 합니다. 75% 알코올로 복부 피부를 소독한다.
   3. 오른손에 주사기를 잡고 바늘로 복부의 흰 선을 피부의 약간 오른쪽으로 3-5mm 뚫습니다. 주사기 바늘과 피부가 45° 각도가 되도록 하고 펜토바르비탈을 복강에 천천히 주입합니다.면도 후 마우스의 절개 부위 주변을 75% 알코올과 클로르헥시딘 용액으로 번갈아 3회 소독합니다.
   4. 마취가 제대로 이루어졌는지 확인 반사가 없었는지 확인하십시오.
2. 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란을 꼬리 정맥에 주입합니다.
   1. 주사기에 100 μL의 10 mg/mL 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란을 준비합니다.
   2. 75% 알코올로 마우스의 꼬리를 닦습니다.
   3. 왼손으로 꼬리를 잡고 바늘을 정맥과 평행하게 오른손으로 주사기를 잡고 100μL 염료를 주입합니다.
   4. 주사 후 면봉으로 출혈을 멈춥니다.
3. 멸균 물에 적신 거즈로 마우스의 복부 털을 담그고 면도기를 사용하여 마우스의 복부를 면도하여 털 방향으로 스트로크합니다. 면도 후 마우스의 절개 부위 주위를 75% 알코올과 클로르헥시딘 용액으로 번갈아 3회 소독합니다.
4. 75% 알코올이 든 발열 패드를 닦은 후 발열 패드를 열고 마우스를 등에 눕혀 히팅 패드에 올려 체온을 37°C로 유지합니다.

2. Body Organ Imaging Frame으로 마우스 간 고정

참고: 상업용 장기 이미징 프레임은 아직 출시되지 않았습니다.

1. 깨끗한 흡입 컵을 고정된 위치에 놓습니다.
2. 장기 영상 고정 장치(그림 1)를 설치하고 가열 패드와 흡입 컵을 75% 알코올로 닦습니다.
3. 흡입 컵(직경 5mm)을 진공 펌프 호스에 연결하고 진공 펌프를 켭니다.
4. 75% 알코올로 멸균된 멸균 테이블에서 75% 알코올과 클로르헥시딘 용액으로 마우스의 절개 부위 주변을 3회 번갈아 소독한 다음 75% 알코올과 클로르헥시딘 용액으로 번갈아 3회 마우스의 절개 부위 주위를 소독한 다음 수술용 가위를 사용하여 마우스의 하부 흉골 경계에서 2cm의 피부를 잘라내고 간을 노출시킵니다.
5. 홀더 베이스에 가열 패드와 함께 마우스를 놓습니다.
6. 흡입 컵이 간을 고정할 수 있도록 장기 영상 고정 장치를 조정합니다. 그런 다음 간이 흡입 컵에 부착되도록 흡입을 위해 30-35kPa의 음압을 사용합니다(그림 2).

3. 다광자 레이저 스캐닝 현미경 조정

1. 다광자 현미경을 켜고 60x/1.00 W 대물렌즈를 선택합니다.
2. 대물 렌즈 아래에 프레임과 마우스를 고정합니다.
3. 흡입 컵의 중심인 렌즈 전체를 덮을 수 있는 생리식염수를 한 방울 떨어뜨리고 대물렌즈를 생리식염수에 닿도록 조정합니다.
4. 컴퓨터 아이콘을 두 번 클릭하여 레이저 소프트웨어를 켜고 스위치를 켭니다. 그런 다음 전원 버튼과 셔터를 3초 동안 길게 누릅니다.
5. 파장을 800nm로 설정합니다.
6. 컴퓨터를 사용하여 현미경 작동 소프트웨어를 시작합니다.
7. 획득 설정의 경우 레이저 800을 설정합니다.

결과

그림 1: 신체 장기 이미징 프레임.(a) 발열 패드: 마우스의 체온을 유지합니다. (b) 브래킷: 마우스를 놓을 수 있는 받침대와 손잡이가 있는 조정 가능한 흡입 컵 위치를 제공할 수 있습니다. (c) 흡입 컵: 브래킷으로 고정됩니다. 음압 펌프가 제공하는 음압은 간이 흡입 컵 중앙의 투명 렌즈에 흡착되도록 합니다. (d) 플렉시블 파이프: 흡입 컵을 압력 펌프와 연결합니다. 압력 펌프는 흡입 컵에 음압을 제공합니다. (e) 원심분리기 튜브: 플렉시블 파이프 중간에 있는 원심분리기 튜브는 액체를 담을 수 있어 이러한 액체가 진공 펌프로 빨려...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 주사기 x 2	후난 Pinan 의료 기기 기술	야0551
5W 가열 패드	BiolinkOptics 기술	BL336
75% 무수 에탄올	광동 Guanghua Sci-Tech	1.17113.023
흡수성 면봉	건강한 위생 왕국
마우스 수술 기구	RWD 생명 과학	SP0001-G	가위와 핀셋 포함
다광자 현미경 검사	올림푸스	FV1200MPE
장기 이미징 픽스처	BiolinkOptics 기술	BL336	흡입 컵, 호스, 음압 펌프 및 브래킷 포함
로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란	시그마	R9379
펜토바르비탈 나트륨	시그마	P3761-25G
면도 기계	레이 와	재-3201