Langendorff 역행성 심장 관류: 고립된 쥐 심장을 관류하는 생체 외 기술

초록

출처: Wu, K. et al. 성체 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를 위한 Langendorff 방법의 수정. J. Vis. 특급 (2021년)

이 비디오에서는 고립된 쥐 심장의 Langendorff 역행 관류를 수행합니다. 시술 중, 상행 대동맥에 삽입된 캐뉼라를 사용하여 관상 동맥을 통해 관류 용액으로 역행하여 심장의 심장 활동을 유지합니다. 이 모델은 심장의 심장 병리 생리학을 연구하는 데 사용됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 용액 및 관류 장치 준비

1. 일정한 흐름의 Langendorff 장치(시판식 또는 자체 제작)를 조립합니다. 그림 1은 간단한 회로도를 제공합니다.
2. 표 1 및 표 2에 제공된 시약에 따라 용액을 준비합니다.
3. 순환 수조를 켜고 적절한 입력 온도(실험실에서는 42.7°C)를 조정하여 캐뉼라에서 관류수 순환 시스템의 유출이 37°C에 도달하도록 합니다.
4. 탈이온수를 순환시켜 관류 시스템을 청소합니다. 멸균 상태가 필요한 경우 관류 시스템을 통해 75% 에탄올을 15분 동안 실행한 다음 탈이온수를 실행합니다(심장에 대한 알코올 독성 영향을 피하기 위해 최소 10주기).
5. 관류액 순환 시스템의 한 주기에 대한 시간과 부피를 측정하여 다음 관류 단계에서 몇 밀리리터의 산소가 공급된 Tyrode 용액을 로드해야 하는지 결정합니다.
6. 원하는 방법으로 모든 수술 도구를 살균하십시오.
7. 관류액 관류 시스템의 유속을 4mL/분으로 설정합니다.
8. 깨끗한 35mm 페트리 접시 두 개를 준비합니다 - 하나는 Tyrode의 용액(페트리 접시 1)을 포함하고 다른 하나는 용액 1(페트리 접시 2)을 포함합니다.
9. 용액 1로 채워진 1mL 주사기와 끝부분까지의 거리가 1mm인 홈이 있는 20G의 뭉툭한 강철 캐뉼러 바늘을 준비합니다. 캐뉼라 샤프트에 3-0 봉합사로 느슨한 매듭을 준비합니다. 조절 view실체 현미경의 필드를 확인하고 캐뉼라 팁이 페트리 접시 2의 액체 표면 아래에 있는지 확인합니다.

2. 동물 준비

1. 혈전을 방지하기 위해 헤파린(농도, 1,000 IU/mL, 0.2 mL/마우스)을 마우스에 복강내로 투여합니다. 10분 후, 펜토바르비탈나트륨(50mg/kg, I.P. 주사)으로 마우스를 마취하고 마우스가 꼬리/발가락 꼬집음에 반응을 멈추는지 확인합니다. 헤파린 투여 후 20분 후에 경추 탈구를 수행합니다.
2. 생쥐를 수술 플랫폼으로 옮기고, 누운 자세로 생쥐를 고정하고, 75% 에탄올로 가슴을 살균하고, 거즈나 냅킨으로 말립니다.

3. 심장 절제 및 대동맥 삽관

1. 조직 겸자로 xiphoid의 피부를 들어 올리고 조직 가위로 피부를 통해 작은 측면 절개를 만듭니다. 피부와 근막 사이를 둔하게 절개하고 피부를 V자 모양으로 절개하여 양쪽 겨드랑이를 향해 뻗습니다.
   1. 흉곽을 통해 동일한 절개 흔적을 계속한 다음 조직 집게로 흉골을 고정하여 심장과 폐를 완전히 노출시켜 흉곽을 위쪽으로 편향시킵니다.
2. 구부러진 집게를 사용하여 심낭을 벗겨냅니다. 흉선이 큰 혈관을 덮고 있는 경우 두 개의 구부러진 집게로 흉선을 양쪽으로 찢습니다. "Y"자 모양의 혈관(대동맥과 분지 동맥)이 보일 때까지 구부러진 집게로 심장 기저부를 꼬리 쪽으로 부드럽게 당깁니다.
3. 캐뉼레이션 형성 및 비교를 위해 대동맥의 다른 길이를 예약하려면 왼쪽 총경동맥(그림 2의 녹색 선)에서 대동맥을 절제하고 일부 마우스에서 상완두동맥을 동시에 절단합니다. 다른 마우스의 상행 대동맥에서 횡단(그림 2의 검은색 선).
   메모: 이 절차를 처음 사용하는 사람들을 위해 이 단계는 실체 현미경에서도 수행할 수 있습니다.
4. 심장을 절제하고 즉시 페트리 접시 1에 담궈 잔여 혈액을 씻고 펌프질합니다.
5. 심장을 페트리 접시 2로 옮기고 필요한 경우 미세한 홍채 가위를 사용하여 남은 조직을 다듬습니다. 이 절차를 처음 접하는 사람들은 대동맥 또는 다른 심장 구조를 잘못 절단하지 않도록 실체 현미경 아래에서 이 단계를 수행하십시오.
6. 대동맥 캐뉼레이션 전에 주사기를 밀어 기포를 배출합니다. 실체현미경 아래에서 두 개의 직선 묶는 집게(부드러운 턱)의 도움으로 역행성 대동맥 캐뉼레이션을 수행합니다. 전체 캐뉼레이션 공정이 액체 표면 아래에 있는지 확인하십시오.
7. 대동맥 판막을 관통하지 말고 상행 대동맥(대동맥이 왼쪽 총경동맥에서 절제된 마우스)과 대동맥근(대동맥이 상행 대동맥에서 대동맥이 절제된 마우스)의 깊이를 각각 조정하십시오.
   메모: 대동맥 캐뉼레이션의 깊이(간단히 깊이라고 함)는 여기에서 캐뉼라 팁이 대동맥에 있거나 대동맥이 결찰되는 위치로 정의됩니다.
8. 매듭 전 3-0 봉합사로 대동맥을 캐뉼라 노치에 접합합니다. 주사기 내용물을 부드럽게 눌러 잔여 혈액을 헹굽니다.
   메모: 혈액은 관상 동맥을 떠나 깊이가 적절하게 배치되면 등쪽 정맥에서 분출됩니다. 심장과 심방 부속기가 팽창하고 창백해질 것이다.
9. 캐뉼러를 제거하고 Langendorff 장치에 연결합니다. 다시 한 번, 기포가 심장으로 들어가지 않도록 주의하십시오.
   메모: 개흉술에서 초기 관류까지의 시간은 5분을 초과해서는 안 됩니다.
10. 심장 관류의 경우, 심방에 잔류 혈액이 있는 경우 먼저 Tyrode의 용액에 약 10초 동안 산소를 공급한 다음(이 프로토콜에 사용된 시스템에서 10초 동안 작동하는 액체의 양은 약 0.7mL) 용액 1로 전환합니다. 그러나 심방에 잔류 혈액이 없는 경우 용액 1로 관류하십시오. 약 2분 동안 심장을 관류합니다.

표 1. 성인용 마우스 CM 분리를 위한 솔루션.

용액	함량 (mmol / L 단위의 최종 농도, 다르게 지정되지 않은 경우)	유명한
관류 용액(용액 1)	113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 타우린, 5 포도당, 10 2,3-부탄디온 모노심(BDM)	4 °C에서 3 일 동안 보관할 수 있습니다. 포도당, 타우린 및 BDM은 실험 당일에 추가됩니다. 각 심장에 대해 200mL의 관류 용액을 준비합니다.
Tyrode의 솔루션 (솔루션 2)	140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 헤페스, 1 CaCl2, 5 포도당	4 °C에서 3 일 동안 보관할 수 있습니다. 실험 당일 CaCl2 및 포도당을 첨가하고 pH 측정기로 실온 (28-30 ° C)에서 포화 NaOH로 pH를 7.3-7.4로 조정합니다.

표 2. 성인용 마우스 CM 격리 및 보관을 위한 솔루션.

으로

용액	목차	유명한
소화 용액 (용액 3)	25 mL 용액 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg 콜라겐 분해 효소 II, 50μL(2.5 % 10×) 트립신	각 하트를 위해
정지 솔루션 1(솔루션 4)	9 mL 용액 1, 1 mL FBS(소 태아 혈청), 4μL 100 mM/L CaCl2	각 하트를 위해
솔루션 2 중지(솔루션 5)	9.5 mL 용액 1, 0.5 mL FBS(소 태아 혈청), 4μL 100 mM/L CaCl2	각 하트를 위해
세포 재현탁액(용액 6)	13 mL 용액 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA(Bull Serum Albumin) 액체 표면을 덮는 얇은 층을 형성할 수 있는 용량	각 하트를 위해

결과

그림 1. 조립된 수정된 Langendorff 시스템의 개략도.이 시스템은 사용자에게 경제적이고 휴대가 간편합니다. 플라스틱 튜브는 물(내경, 8mm)과 관류액(내경, 1.5mm)의 두 부분으로 구성되어 있으며, 그 중 말단 끝은 루어 잠금 장치가 있는 PE 의료용 3방향 마개에 연결됩니다. 물이 들어 있고 고무 마개가 있는 유리병은 열교환기 형태입니다. 관류액은 연동 펌프에 의해 열교환기의 플라스틱 튜브로 펌핑되고 캐뉼라에 연결된 3방향 마개에서 나옵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2,3-부탄디온 단산소(BDM)	시그마-알드리치	31550
염화칼슘2	시그마-알드리치	C4901
포도당	시그마-알드리치	G7528 (영문
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
케이클	시그마-알드리치	P9333
KH2사서함4	시그마-알드리치	P5655
KHCO3	시그마-알드리치	237205
재질 보기 MgCl2	시그마-알드리치	M8266
재질 보기 MgSO4	시그마-알드리치	M7506
나2HPO4	시그마-알드리치	S7907
염화나트륨	시그마-알드리치	S7653
나HCO3	시그마-알드리치	S5761
연동 펌프	롱거펌프	BT100-2J
황소자리	시그마-알드리치	T0625
수조	줄라보	에드 (v.2)

년 ) ) (영문) (영문) (한국어판)