Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: 마우스 대동맥 판막에서 VIC를 분리하고 배양하는 효소 방법

초록

출처: Bouchareb, R. et al. 체외 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위한 마우스 간질성 판막 세포의 격리. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오에서는 성인 마우스의 심장에서 대동맥 판막 간질 세포를 2단계 콜라겐분해효소 절차를 사용하여 분리하고 이후 소량의 성장 배지에서 배양하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 성체 마우스에서 판막 세포 분리 전 준비

1. 그림 1A에 표시된 모든 수술 기구를 70% v/v 에탄올을 사용하여 세척하고 멸균한 다음 30분 동안 고압멸균합니다. 70% 에탄올로 수술 공간을 청소합니다.
2. 500μL의 페니실린-스트렙토마이신을 10mm HEPE 50mL에 첨가합니다. 50mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)의 부분 표본을 준비합니다. 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
3. 1mg/mL 및 4.5mg/mL 콜라겐분해효소 용액을 준비하고 15mL 튜브에 각 용액을 5mL씩 사용하여 전체 절차를 수행합니다. 1mg/mL 콜라겐분해효소 5mL를 준비하려면 콜라겐분해효소 5mg을 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM, 소 태아 혈청(FBS) 없음) 2.5mL 및 항생제가 보충된 10mM HEPES 2.5mL(1.2단계의 페니실린-스트렙토마이신 1%)와 혼합합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과하여 오염물을 제거합니다.
   메모: 효소를 보호하기 위해 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
4. 사용하기 전에 아래 설명된 모든 단계를 수행하기 전에 DMEM 용액을 37°C로 예열합니다. DMEM에 페니실린-스트렙토마이신 1%, 피루브산 나트륨 1%, 200mM L-글루타민 5mL, 마이코플라즈마 제거 시약 1mL(재료 표 참조) 및 10% FBS를 보충하여 완전한 배지를 준비합니다.

2. 밸브 셀의 절연

1. 실험을 위해 10⁶ 개의 세포를 얻으려면 8 주 된 마우스 5 마리 (최소 3 개)를 사용하십시오. 1mL의 이소플루란을 적신 작은 티슈 조각과 함께 마우스를 유도 챔버에 넣되 조직과의 접촉은 허용하지 않습니다. 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해; 발가락 핀치 반사를 확인한 다음 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 경추 탈구 전에 통증을 완화하기 위해 이소플루란을 사용하십시오. 아래에 설명된 절차는 말기이므로 사용하십시오.
2. 해부 플랫폼에 마우스를 놓고 캐뉼러로 발을 고정하여 제자리에 고정합니다. 에탄올로 가슴과 복부를 청소하십시오. 복부와 가슴을 가위로 엽니다. 작은 수술용 가위로 좌심방과 좌심실 사이를 잘라 쥐를 출혈시킵니다. 차가운 1x PBS 10mL로 심장을 관류하여 심장에서 혈액을 제거합니다.
3. 심장을 절단하고 그림 1B와 같이 상행 대동맥에서 3mm 떨어진 곳에 있습니다. 실체현미경으로 대동맥 판막을 절개합니다. 심실 중앙에서 심장을 수평으로 자릅니다(그림 1C). 좌심실을 대동맥 쪽으로 자르고 대동맥 판막을 조심스럽게 절개합니다(그림 1D-F). 35mm의 작은 조직 배양 접시에 밸브를 함께 모읍니다.
4. 항생제(1% 페니실린-스트렙토마이신) 5mL를 첨가한 75mm 세포 배양 접시에 분리된 판막을 세척하여 혈액을 제거합니다(그림 2). 1.3단계에서 위에서 설명한 대로 콜라겐분해효소 1mg/mL 및 4.5mg/mL의 15mL 튜브 2개를 준비합니다.
   메모: 해부 후 멸균 생물 안전 후드에서 분리된 밸브를 조작하여 오염을 최소화합니다.
5. 콜라겐분해효소 I형(1mg/mL)의 판막을 37°C에서 30분 동안 지속적으로 흔들어 배양합니다(그림 2). 튜브를 150 × g에서 5 분 동안 원심 분리하고 펠릿을 2mL의 HEPES(10 mM)로 한 번 세척한 다음 고속으로 30초 동안 와류를 사용합니다. 이 튜브의 내용물을 35mm 배양 접시에 붓고 얇은 핀셋을 사용하여 조직 조각을 새 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
   메모: 이 단계에서 VIC는 여전히 조직에서 해리되지 않았으며 펠릿에는 조직 조각이 포함되어 있습니다. 내피 세포의 오염을 방지하려면 2.5단계에서 볼텍싱 후 원심분리하지 마십시오.
6. 펠릿을 5mL의 콜라겐분해효소 I형(4.5mg/mL)과 함께 37°C에서 35분 동안 계속 교반하면서 15mL 튜브에 주입합니다.1mL 피펫으로 세포를 다시 현탁시켜 세포를 분리하고 4°C에서 5분 동안 150×g으로 원심분리합니다.
7. 상등액을 버리고 완전한 DMEM 2mL에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 150 × g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기. 이 단계를 두 번 반복하여 세포를 청소합니다.
   메모: 펠릿에는 여전히 약간의 조직 조각이 있습니다.
8. 펠릿을 1mL의 완전한 배지에 다시 현탁시키고, 배양 접시에 쉽게 부착할 수 있도록 최소한의 배지에 있는 6웰 세포 배양 접시의 한 웰에 세포를 플레이트화합니다. 세포를 5% 이산화탄소가 함유된 37°C 인큐베이터에 그대로 두십시오.
9. 3일 후, 현미경으로 세포를 확인하여 조직 파편 근처에서 잘 자랐는지 확인합니다. 현미경으로 1,000개의 세포가 보이면 오토클레이브 핀셋으로 조직 파편을 조심스럽게 제거하고 배지를 변경합니다.
   메모: 접시를 방해해서는 안 됩니다. 필요한 세포 수가 관찰되지 않으면 세포 배양 접시를 인큐베이터에 다시 2일 동안 넣습니다.

결과

그림 1: 판막 절제에 대한 설명. (가) 해부에 필요한 모든 수술 기구의 대표 이미지로, 쥐의 피부를 열려면 가위(2)가 필요하고 가슴을 열려면 가위(3)가 필요합니다. 핀셋 5와 6은 피부를 잡고 가슴을 여는 데 필요합니다. (나) 대동맥에서 3mm의 조직을 남겨 둡니다(검은색 화살표). (씨) 심실 중앙의 심장을 가위 4 번으로 자릅니다. (디

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3mm 절삭 날 가위	F.S.T	15000-00
본 가위	F.S.T	14184-09
콜라겐분해효소 I형(125단위/mg)	써모피셔 사이언티픽	17018029
DMEM을 참조하십시오.	써모피셔	11965092
매우 미세한 graefe 집게	F.S.T	11150-10
FBS(증권 시세	Gibco 16000044
가는 집게	F.S.T 뒤몽
HEPES 1M 솔루션	스템셀 기술
L-글루타민 100x	써모피셔 사이언티픽	A2916801
마이코잡	란자	VZA-2011	마이코플라스마 제거 시약
PBS 10배	시그마-알드리치
펜슬린 스트렙토마이신 100x	써모피셔 사이언티픽	10378016
나트륨 피루브산 100 mM	써모피셔 사이언티픽	11360070
표준 패턴 겸자	F.S.T	11000-12
수술용 가위 - 샤프-블런트	F.S.T	14008-14
트립신 0.05%	써모피셔 사이언티픽	25300054