마우스 배아 요로에 메틸렌 블루 염료 주입: 요로의 선천적 폐색을 평가하는 방법

초록

출처: Yun, K. 메틸렌 블루 염료 주입에 의한 요로 접합 폐쇄 결함 평가. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오에서는 요로 폐쇄와 관련된 선천적 기형을 평가하기 위해 주산기 배아 마우스의 요로에 메틸렌 블루 염료 주사를 투여합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 메틸렌 블루 염료 용액의 제조

1. 메틸렌 블루 파우더 0.1g을 측정합니다.
2. 볼텍싱(vortexing)을 통해 메틸렌 블루를 10mL 생리식염수 또는 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 완전히 용해시킵니다.
3. 10mg/mL 메틸렌 블루 용액을 주사기 필터(멤브레인 기공 크기 0.45μm)로 여과하여 주입 중 막힘을 제거합니다.
4. 멸균 두피 정맥 세트(27G x 3/4")를 3mL 일회용 주사기로 조립하고 주사기에 3mL 여과된 메틸렌 블루 용액을 채웁니다.
   메모: 정수압 및 후속 염료 흐름을 방지하려면 메틸렌 블루 용액으로 채워진 주사기 위에 바늘 끝을 놓습니다.

2. 태아 배아 해부

1. 해부 가위와 집게를 70% 에탄올로 세척합니다.
2. E18.5 또는 E19.5에서 주산기 배아를 채취하려면 먼저 CO₂ 흡입을 사용하여 임신한 마우스를 안락사시킨 다음 NIH 지침에 따라 자궁경부 탈구를 수행합니다.
   메모: 임신한 암컷 쥐는 보통 E18.5부터 출산하지만, 신장이 클수록 조작하기가 더 쉽습니다. 따라서 출생 시기가 가까워진 E19.5의 신장은 이 분석을 수행하기가 더 쉽습니다. 그러나 양측 요로 폐색이 있는 새끼는 출생 후 죽습니다. 실험용 마우스의 특성에 따라 적절한 채취일/시간을 경험적으로 결정해야 합니다.
3. 복부 복부 표면에 70% 에탄올을 분사한 다음 해부 가위와 집게를 사용하여 복강을 복부로 엽니다.
4. 자궁 전체를 들어 올려 자궁 뿔 끝을 해부 가위로 잘라 몸에서 분리합니다.
5. 페트리 접시에 1x PBS로 자궁 전체를 헹굽니다.
6. 해부 가위로 자궁을 분절하고 해부 집게로 태반 decidua를 제거하여 난황낭에 담긴 배아를 노출시킵니다.
7. 먼저 난황낭을 제거한 다음 해부 겸자로 양막을 제거하여 주산기 배아를 해방시킵니다.
8. 해부 가위로 배아의 목을 베십시오. 멸균 거즈 패드로 과도한 혈액을 닦아냅니다. 배아의 복부 표면이 위로 향하게 하여 이미징용 디지털 카메라가 장착된 해부 현미경에 배아를 고정합니다. 필요한 경우 유전형 분석을 위해 꼬리를 수집합니다.
   메모: 한 번에 하나의 배아씩 주사를 수행합니다.
9. 피부를 찢어 집게로 배아의 복강을 조심스럽게 엽니다. 그런 다음 간, 위, 장과 같은 여분의 장기와 조직을 집게로 잘라내거나 당겨 등쪽에 위치한 신장, 요관, 방광이 드러나도록 조심스럽게 제거합니다(그림 1A). 필요한 경우 멸균 거즈 패드로 절개된 배아에서 과도한 혈액을 흡수합니다.
   메모: 과도한 혈액은 염료 주입을 위한 신장 골반의 식별을 방해합니다.

3. 신장 골반에 메틸렌 블루 염료 주입 및 염료 흐름 모니터링

1. 정수압에 의해 바늘 끝에서 메틸렌 블루 용액을 배출하여 바늘과 튜브의 기포를 제거합니다. 염료 용액이 들어있는 주사기를 바늘 끝 높이 이상으로 들어 올려 흐름을 시작한 다음 주사기를 내려 흐름을 멈춥니다.
2. 근위 요관 근처의 신장 골반에 바늘을 삽입하고 한 번 놓으면 방해하지 않도록 주의하십시오. 요로 폐색을 확인하기 위해 신장에 염료 주입을 수행합니다.
   메모: 비정상적인 신장에 염료 주입을 먼저 수행하여 요로 폐쇄를 확인하기 위해 동일한 방법을 따르십시오.
3. 주사기를 약 20cm 위로 들어 올려 정수압을 제공하고 15 μL–60 μL의 염료 용액이 흐르도록 합니다. 유속은 주사기가 배아 위로 이 높이까지 올라갈 경우 약 3μL/s가 됩니다.
4. 먼저 신장 골반에서 시작하여 요관의 길이, 마지막으로 방광 내강에서 염료의 파란색을 모니터링합니다.
   메모: 요관이 방광에 제대로 삽입된 경우 방광 내강 내에서 약한 염료 색이 나타나는 것을 보는 데 약 5초가 걸립니다. 방광 내강에 염료 색이 나타나지 않으면 약 15초 동안 막힌 부위에 염료가 축적되도록 합니다.
5. 염료의 흐름을 막기 위해 주사기를 내려놓고 신장에서 바늘을 제거합니다.
6. 신장, 요관, 방광을 실체현미경에 연결된 카메라와 이미징 프로그램을 사용하여 염료 용액으로 추적하여 이미지를 촬영합니다.
7. 신장의 신수증, 수뇨관 및 염료 용액의 최종 위치를 실험실 노트에 기록합니다.
8. 3.1-3.5 단계에서 설명한대로 반대쪽 신장 주입을 수행하고 총 20 초 동안 염료가 흐르도록 허용합니다 .
   메모: 방광 내강은 요관이 방광 내강에 제대로 삽입된 경우 강한 파란색으로 표시되는 염료 용액으로 채워집니다. 요로 접합부 폐쇄를 평가한 후, 요관과 방광을 절편으로 고정할 수 있습니다.

결과

그림 1. 메틸렌 블루 염료를 정상적인 비뇨기계에 주입하는 예. (가)과도한 조직을 제거한 후 주산기 배아(E19.5)의 비뇨기 시스템의 일반적인 이미지. 두 개의 신장, 두 개의 요관 및 방광이 생식 기관과 함께 보이며, 여기서는 고환 (B) 정상 신장에 염료를 주입하는 예. 신장의 신장 골반에 주입되는 주사 지점(검은색 화살표)을 볼 수 있습니다. 염료가 5초 동안 흐르도록 한 후 요관과 방광 내강에서 약한 염료 색이 보입니다. (C) 양쪽 정상 신장 주사 후 방광 내강에 염료가 축적됩니다. 염료가 20초 동안 흐르도록 한 후 방광 내강에 염료 용액이 축적되어 색이 강해집니다. 신장 골반도 신장에서 약한 염료 색으로 볼 수 있습...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
메틸렌 블루	시그마-알드리치	M9140
Quality Biological Inc. 일반 식염수 - 500ML	피셔사이언티픽	50-983-204
BD Luer-Lok 팁이 있는 3mL 일회용 주사기	BD (영어)	309657
Acrodisc 주사기 필터(Supor 멤브레인 포함	Pall 주식회사	4614
Exel 두피 정맥 (나비) 세트; 27G x 3/4 "12"	엑셀린트	26709
섬세한 작동 가위	Roboz 수술 기구 Co.	RS-6702
마이크로 해부 겸자	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5135
듀몬트 핀셋; 패턴 #5	Roboz 수술 기구 Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide 바늘 30G x 1/2 "	BD (영어)	305106