마우스 전방 난모세포 분리: 갓 수확한 마우스 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법

초록

출처: Monti, M. et al. 핵 염색질 조직을 기반으로 한 마우스 전방 난모세포의 분리 및 특성화. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 갓 채취한 쥐 난소에서 전방 난모세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이러한 전방 난모세포는 추가 특성화 및 발달 연구에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물

1. 3주에서 6주 된 성인 암컷 쥐를 온도와 습도가 조절된 방에 보관하십시오(12L:12D의 위상 및 임시로 먹이기).
2. 생쥐에게 2.5IU의 임산부 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)을 복강내 주사하여 난포 자극 호르몬(FSH)의 효과를 모방하여 여포 성장을 자극합니다. 48시간 후 전방 난모세포 수집을 위해 난소를 분리합니다. 이전에 PMSG를 주입한 암컷 마우스를 표준 지침에 따라 안락사시킵니다.
3. 체강에서 난소를 빠르게 제거하고 후속 난모세포 분리를 위해 M2 배지가 포함된 페트리 접시에 넣습니다(섹션 3 참조).
   1. 복벽을 덮고 있는 피부를 절개한 후 멸균 해부 가위를 사용하여 복막을 절개합니다. 절개 부위를 열어 복부를 드러내고, 멸균 핀셋을 사용하여 한쪽의 장을 움직여 방광에서 시작하여 V자 모양을 형성하여 자궁관을 국소화합니다.
   2. 신장 아래에 위치한 난소를 관찰합니다. 멸균 핀셋으로 각 튜브를 잡고 난소 아래쪽을 작게 절개하여 풀어줍니다. 사전 평형 배지를 포함하는 페트리 접시의 바닥에서 두 난소를 옮깁니다.

2. 호르몬 준비

1. PMSG(다양한 스톡 농도에서 사용 가능)를 멸균 등장성 식염수로 희석하여 적절한 주입량에 대해 0.1mL당 2.5IU 호르몬의 작업 농도를 얻습니다.
   메모: 호르몬 용액은 0.5mL 튜브에 분주해야 하며 사용 당일까지 -20°C에서 보관해야 합니다. 희석된 부분 표본을 -20 °C에서 3개월 이상 보관하지 마십시오. 해동 후 연속 주사를 수행하는 경우 호르몬 용액의 부분 표본을 +4 °C에서 보관하고 4 일 이내에 사용하십시오.

3. 전방 난모세포 격리

적절한 난모세포 격리를 위해:

1. 난모세포 분리 절차를 시작하기 전에 최소 1시간 동안 5% CO₂ 및 37°C에서 M2 매체(M2)를 평형화합니다. 두 개의 페트리 접시(35mm x 10mm)를 준비하는데, 하나는 난소 천자를 위한 M2 1mL가 들어 있고, 난소에서 분리된 후 난모 세포 이동을 위해 미네랄 오일(~1.5mL)로 덮인 M2 작은 방울(20μL)이 있는 접시를 준비합니다(3.4–3.6 단계 참조). 사용할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 있는 두 페트리 접시를 5% CO₂ 및 37 °C로 유지하십시오.
2. 난모세포 분리 절차 중 실체현미경을 사용합니다.
3. 분젠 버너에서 나오는 수직 화염 위에 수평으로 유지되는 유리 파스퇴르 피펫을 늘리고(양손으로 피펫 끝을 잡고) 난모세포를 수집하기 위해 얇은 입 유리 피펫을 준비합니다(그림 1).
   1. 유리가 녹기 시작하면 화염에서 피펫을 꺼내고 빠르게 당기는 동작을 수행하여 원하는 피펫을 얻습니다. 여분의 유리를 손톱으로 피펫의 좁은 부분에 가깝게 단단히 잘라 내부 모세관의 길이와 직경을 조정하십시오. 얇은 모세혈관의 내부 직경이 난모세포의 직경(~80μm)보다 약간 큰 ~100μm인지 확인합니다.
   2. 입 피펫을 사용하려면 적절한 팁을 사용하여 흡입기 튜브의 한쪽 끝을 당겨진 피펫에 연결하고 다른 쪽 끝을 입에 넣고 치아로 고정합니다.
4. 멸균 핀셋을 사용하여 난소를 채취하여 세포 배양 페트리 접시(35mm x 10mm)의 바닥에 놓습니다. 이전에 37°C 및 5% CO₂에서 평형을 이룬 1mL의 M2로 덮습니다(그림 2).
5. 멸균 인슐린 주사기 바늘로 난소의 앞 여포를 부드럽게 뚫어 M2의 앞 난모세포를 방출합니다(그림 3).
6. 좁은 파스퇴르 피펫을 통해 난모세포를 부드럽게 입으로 피펫으로 삽입하여 난포 세포 및 기타 가능한 조직 파편을 제거한 다음(그림 4A) 배아 배양에 적합한 미네랄 오일로 덮인 M2의 작은 방울(20μL) 바닥에 가라앉힙니다(미리 준비됨; 그림 4B).
   메모: 난모세포의 투명대(zona pellucida)에 부착된 모든 적운 세포를 여러 차례 다른 M2 방울을 통해 지속적으로 피펫팅하여 제거하는 것이 중요합니다. 매체의 pH 변화를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 이 단계를 수행하십시오.

결과

그림 1. 유리 파스퇴르 피펫과 분젠 버너를 사용한 입 피펫 준비.

그림 2. 예열 및 평형 M2 배지로 채워진 페트리 접시의 온전한 난소.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
증권 시세	시그마	G4527
엠브리오맥스 M2	밀리포어	MR-015-PD
미네랄 오일	시그마	M8410
세포 배양 접시 35mm x 10mm	코 닝	430165
μ-접시 35mm, 높은 유리 바닥	이비디	81158
피펫 파스퇴르 붕규산	코 닝	7095D-9
교정된 micropillary 피펫을 위한 Aspirator tube 어셈블리	시그마	A5177