담즙계 수지 주조: 방사선 불투과성 수지 주입을 이용하여 쥐 모델에서 담즙계의 3D 구조를 분석하는 기법

초록

출처: Hankeova, S. et al. DUCT: 3D 간 분석을 위한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 이은 이중 수지 주조. J. Vis. 특급. (2021년)

이 비디오는 3D 담도 구조를 이해하기 위한 담도 시스템 수지 주조 절차를 설명합니다. 이 기술은 담도계의 내부 직경과 네트워크 연결성에 대한 통찰력을 제공하며, 이는 간 재생 분석에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 이중 수지 주입

1. 준비
   1. 수지 용액을 준비합니다. 이중 시스템 수지 주입의 경우 1.1.2-1.1.4 단계에 설명된 대로 노란색 및 녹색 수지를 모두 준비합니다.
   2. 마우스당 1mL의 희석된 수지 분취액을 준비합니다.
   3. Yellow Resin: 노란색 실리콘 고무(방사선 불투명도가 높음)를 투명 희석액으로 3:1 희석하여 주입용 노란색 수지를 제조합니다.
   4. 그린 레진: 블루 실리콘 고무(검출되지 않는 방사선 불투과)와 투명 희석제를 1:1 희석액으로 혼합하여 블루 레진을 제조합니다. 녹색 수지를 생성하려면 희석된 파란색 수지와 희석된 노란색 수지를 1:1의 비율로 혼합합니다. 색상이 균일해질 때까지 녹색 수지를 철저히 소용돌이칩니다.
      메모: 파란색 수지는 microCT로 검출할 수 없는 방사선 불투과성이 매우 낮기 때문에 방사선 투과도가 다른 두 개의 수지를 만들기 위해 노란색 수지로 희석해야 합니다.
      주의: 수지에는 발암 물질인 크롬산납이 포함될 수 있습니다. 화재에서 유독 가스를 생성합니다. 조심스럽게 다루고 수지를 유해 폐기물로 폐기하십시오.
   5. 1.1.6-1.1.11.
      단계에 설명된 대로 튜브가 있는 두 개의 주입 세트(주입 세트 #1 및 주입 세트 #2)를 준비합니다. 메모: 성체 마우스(>P30(출생 후 30일) = P30 - 2세)의 경우 일반 담관 주입에는 주입 세트 #1(외경 0.6mm의 PE10 튜빙)을 사용하고 문맥 주사에는 주사 세트 #2(외경 0.96mm의 PE50 튜빙)를 사용합니다. 어린 산후 마우스(최대 P30)의 경우 담관용 및 문맥 주사용 총 2개의 #1 주사 세트를 준비합니다(문맥이 너무 좁아서 PE50 튜브를 수용할 수 없으므로 주사 세트 #2 없음).
   6. 주입 세트 #1을 준비하려면 PE10 튜빙 30cm를 절단하고 가능한 한 얇아질 때까지 튜빙의 한쪽 끝을 손으로 당겨 늘립니다(그림 1A, B, 직경 약 0.15mm, 비늘어남 PE10 튜빙은 직경 0.6mm).
   7. 늘어난 PE10 튜브의 끝을 대각선으로 잘라 비스듬한 팁을 만듭니다(그림 1B).
   8. PE10 튜브의 늘어나지 않은 끝을 30G 바늘에 연결합니다(그림 1A, 주입 세트 #1).
   9. 주입 세트 #2를 준비하려면 PE50 튜빙 30cm를 절단하고 문맥에 들어갈 수 있을 만큼 얇아질 때까지 튜빙의 한쪽 끝을 손으로 잡아당겨 늘립니다(그림 1A, B, 약 0.7mm, 비늘어남 PE50 튜빙은 직경 0.96mm).
   10. 늘어난 PE50 튜브의 끝을 대각선으로 잘라 비스듬한 팁을 만듭니다(그림 1B).
   11. PE50 튜빙의 늘어나지 않은 끝을 23G 바늘에 연결합니다(그림 1A, 주입 세트 #2).
       메모: 각 주입 세트는 수지가 주사기와 튜브에서 경화되기 때문에 한 번의 주입에만 사용할 수 있습니다. 생쥐의 총담관과 문맥의 크기에 따라 나이, 유전자형 및 표현형에 따라 늘어나고 비스듬한 팁의 크기를 조정합니다. 튜브의 크기와 적합성이 확실하지 않은 경우 절개 후 튜브에 레진이 채워지기 전에 튜브를 적절한 덕트 또는 혈관에 삽입하십시오. 튜브가 너무 넓어서 덕트/용기에 맞지 않으면 더 늘리십시오.
   12. 이소플루란 흡입으로 동물을 마취합니다(처음 4%는 유도실에서, ~2%는 노즈 콘을 사용).
   13. 마우스가 콧방울을 통해 이소플루란을 호흡하는 동안 해부 패드의 통풍이 잘 되는 벤치에 마우스를 놓습니다. 기관/IRB에서 권장하는 방법(예: 발 중 하나를 꼬집음)으로 동물이 의식을 잃었는지 확인합니다.
       주의: 이소플루란은 흡입 시 졸음이나 현기증을 유발할 수 있으며 장기간 또는 반복적으로 노출되면 심혈관계와 중추신경계에 손상을 줄 수 있습니다. 흡입하지 마십시오. 환기가 잘 되는 벤치와 환기가 잘 되는 곳에서 물질을 취급하십시오.
       메모: 심장 관류와 호환되는 한 다른 마취 방법을 사용할 수 있습니다.
   14. 동물이 의식을 잃으면 복부 쪽에 70% 에탄올을 뿌려 털의 간섭을 방지합니다.
   15. 피부 가위를 사용하여 복강 정중선에서 시작하여 피부, 근막, 근육층을 절개하고 흉강까지 절개하여 내부 장기를 노출시킵니다.
   16. 집게로 xiphoid process를 잡고 흉골을 들어 올리고 양쪽의 횡격막과 흉곽을 잘라 심장과 폐를 노출시킵니다.
   17. 흉곽의 왼쪽과 오른쪽에 있는 갈비뼈를 가위로 잘라 흉곽을 제거합니다. 수지가 누출될 수 있으므로 간이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오.
   18. 곧은 집게를 사용하여 심장을 간 쪽으로 당기고 오른쪽 심방을 잘라냅니다.
   19. 연동 관류 펌프에 연결된 버터플라이 바늘(23G)을 좌심실에 삽입합니다. Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)과 heparin(마우스 체중의 1U/g)을 마우스에 경심으로 관류합니다. 5mL/min.
       의 관류 속도로 3분 동안 관류 메모: 마우스가 올바르게 관류되면 내부 장기, 특히 간이 창백해집니다. 대신 폐가 하얗게 변하면 바늘을 우심실에 삽입하고 위치를 변경해야 합니다. 관류 후 마우스는 출혈되고 콧방울과 이소플루란에서 제거할 수 있습니다.
   20. 이소플루란 펌프를 끕니다.

2. 수지 주입 - 담즙 체계 수지 주물

1. 마우스를 해부 현미경으로 옮기고, 복부는 위로, 꼬리는 실험자 쪽으로, 실험자에게서 멀어집니다. 관심 있는 해부학적 랜드마크는 그림 2A에 나와 있습니다.
2. 장을 옆으로 움직여 하대정맥(그림 2A)을 찾습니다. 스프링 가위를 사용하여 하대정맥을 작게 횡단절개하여 간 혈관 압력을 방출할 수 있도록 합니다(그림 2Bi).
3. 1.2.4-1.2.6 단계에 설명된 대로 총담관과 문맥을 노출시킵니다.
4. 인산염 완충 식염수(PBS)에 적신 면봉을 사용하여 장과 췌장을 (실험자의) 오른쪽으로 이동합니다.
5. PBS에 적신 면봉을 사용하여 간의 복부 쪽을 심장 쪽으로 뒤집어 내장 표면과 문턱 부위를 노출시킵니다.
6. 문턱 영역에서 췌장을 가로질러 Oddi의 괄약근에서 장으로 이어지는 총담관을 찾습니다(그림 2Bii, 노란색 점선으로 윤곽이 표시된 총담관, 검은색 화살촉은 Oddi의 괄약근을 가리킴).
   메모: 시술 내내 간에 PBS를 뿌려 간이 촉촉한지 확인하십시오.
7. 직선 집게를 사용하여 총담관에서 주변 조직(면적 ~5mm)을 제거합니다. 실크 봉합사(크기 4-0, 0.17mm, 3-5cm 길이)를 총담관(그림 2Bii) 아래에 놓고 총담관 주위에 느슨한 오버핸드 매듭을 묶습니다(그림 2Biii).
   메모: 문맥 영역과 오디의 괄약근 사이의 중간에 매듭을 위한 영역을 선택하고 문맥에서 약간 떨어진 곳에 두어 총담관 주위의 봉합사를 조인 후 문맥 주입을 방해하지 않도록 합니다.
8. 용수철 가위를 총담관에 평평하게 대고 총담관이 Oddi의 괄약근 옆 췌장과 장으로 들어가는 지점의 총담관을 비스듬히 절개합니다. (그림 2Biv), 노란색 점선은 검은색 화살표로 강조된 Oddi 영역의 괄약근을 나타냅니다).
   메모: 이것은 중요한 단계입니다. 횡단이 아닌 비스듬한 절단을 하고 절개를 만듭니다. 담관을 절단하지 마십시오. 담관 전체를 절단하면 튜브를 삽입하는 것이 매우 어렵습니다.
9. 사용 직전에 노란색 수지 1mL와 경화제 50μL를 혼합하고(1mL 주사기를 채우고 비우는 방법) 1mL 루어 주사기에 수지 경화제 혼합물을 채웁니다.
10. 채워진 주사기를 튜브(세트 #1)에 연결합니다. 플런저를 눌러 튜브를 완전히 채웁니다. 수지/경화제 혼합물이 tubing.
    끝에서 떨어지는지 확인합니다. 메모: 최상의 결과를 위해 주사기와 튜브의 기포를 피하고 제거하십시오.
11. 겸자를 사용하여 총담관 절개 부위 주변을 곧게 펴고 튜브를 총담관의 구멍(그림 2Bv)에 삽입하되, 비스듬한 끝의 가장 긴 가장자리가 담관의 등쪽을 향해 아래쪽으로 향하게 합니다. 이 방향은 수지가 위쪽을 향하는 튜브 개구부를 통해 덕트로 들어갈 수 있도록 합니다(그림 2Bv).
12. 실크 실 매듭을 조여 총담관 내부에 튜브를 고정합니다(그림 2Bvi).
13. 수지를 총담관에 주입합니다. 담낭과 개별 간엽을 관찰합니다.
14. PBS에 적신 면봉으로 간을 마사지하면 수지가 고르게 펴 바를 수 있습니다. 수지로 채워진 담관의 말단 가지(야생형 마우스)는 간 표면에서 희미하게 보입니다.
    메모: 간을 채우는 예상 시간은 30-100초입니다.
15. 간 표면에 수지 점이 나타나거나(그림 2Ci, 파란색 화살표) 저항성이 충족되면 수지 주입을 중단하십시오.
    메모: 수지 경화제를 첨가한 후 수지가 굳어지기 시작하므로 가능한 한 빨리 작업하십시오. 경화제를 첨가한 후 작업 시간은 약 15분입니다.
16. 총담관에서 튜브를 당겨 튜브를 제거하고 수지가 새는 것을 방지하기 위해 집게를 사용하여 실크 매듭을 빠르게 조입니다. 실크 봉합사의 느슨한 끝을 잘라내어 문맥 주입을 방해하지 않도록 합니다.
17. 수지가 들어 있는 튜브와 남은 수지는 유해 폐기물에 버리고 바늘은 날카로운 쓰레기에 버리십시오.

결과

그림 1: 수지 주조용 주입 세트.(A) 주입 세트 #1은 30G 바늘과 ~30cm 길이의 PE10 튜브로 구성됩니다. 주입 세트 #2는 23G 바늘과 ~30cm 길이의 PE50 튜브로 구성됩니다. (B) 튜브의 끝부분을 늘리고 비스듬히 절단하여 비스듬한 팁을 만듭니다. A와 B의 눈금자는 센티미터 눈금자로, 장증분은 1cm, 중간증분은 5mm, 단

증분은 1mm입니다.

그림 2: 이중 수지 주조 흐름도.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL SafeSeal 마이크로 튜브	사르슈테트	72.706
튜브가 있는 버터플라이 바늘 23G	BD 생명과학	367283
23 G바늘	BD 생명과학	305892
30G 바늘	BD 생명과학	305106
아가로스	탑-바이오	P045
벤질 알코올	시그마 알드리치	108006
벤질 벤조에이	시그마 알드리치	B6630
Corning 50 mL 튜브	시그마 알드리치	CLS430829-500개	폴리프로필렌
면봉	메디카리어	60406
해부 현미경	라이카 카메라 AG	라이카 M60
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	써모피셔 사이언티픽	14190144
에탄올 70%	폭스바겐	83801.41
팔콘 튜브 15 mL	베르콘	331.850.084.006
구부러진 집게	정밀 과학 도구	11051-10	파인 그레이프 10cm 곡선
집게 스트레이트	정밀 과학 도구	11050-10	파인 그레이프 10cm 스트레이트
포름알데히드 용액	시그마 알드리치	F8775
행크스의 균형 잡힌 소금 솔루션	써모피셔 사이언티픽	14025092
덤플링을	레오 파마	B01AB01	5000 IE/mL
이솔푸란	백스터	FDG9623
메탄올	써모피셔 사이언티픽	11413413
마이크로필	플로우테크	MV-122	합성수지 옐로우
마이크로필	플로우테크	MV-120	합성수지 블루
마이크로필	플로우테크	MV-희석제	투명 수지 희석제
파스퇴르 피펫	베르콘	130.690.424.503
연동 펌프	아그토스	010.6131.M20
로커	폭스바겐	Tel.: 444-0142
실크 봉합사	아그토스	14757	검은 실크, 4-0, 멸균, 100m
스킨 가위	정밀 과학 도구	14058-09	아이리스 스트레이트 팁 9cm
스프링 가위	정밀 과학 도구	15000-03	Vannas 마이크로, 스트레이트 팁 2mm
주사기 1mL Luer	BD 생명과학	303172
튜빙 PE10	BD 생명과학	427401
튜빙 PE50	BD 생명과학	427411