마우스 모델에서 동방결절 분리: 쥐 심장에서 SA 결절을 채취하는 절차

초록

출처: Kumar, P et al., 마우스의 내재적 심장 박동기 결손을 식별하기 위한 중심방 노드 발사 속도의 미세 전극 어레이 기록. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 쥐의 심장에서 동방결절 또는 SAN을 분리하는 절차를 보여줍니다. SAN은 자발적인 활동 전위를 생성하여 심장 박동을 시작하는 동방 세포를 수용합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동방결절(SAN) 해부

1. SAN 해부를 위한 heparinized Complete Tyrode의 솔루션을 준비합니다.
   1. 400μL의 헤파린(1,000USP/mL)을 Complete Tyrode 용액 40mL에 넣고 37°C 수조에서 데웁니다.
2. 마우스에 200-300 μL의 헤파린(1000 USP/mL)을 복강내 주사하고 동물을 10분 동안 앉혀 둡니다.
3. 이소플루란 과다 투여로 헤파린화된 마우스를 안락사시킵니다.
   1. 구멍이 뚫린 플라스틱 튜브 내부의 여과지에 200-300μL의 액체 이소플루란을 첨가하여 생성된 이소플루란 증기가 포함된 작은 유리 챔버에 마우스를 넣습니다.
      알림: 이소플루란은 피부 자극을 유발할 수 있고 피부를 통해 흡수될 수도 있기 때문에 액체가 마우스에 직접 닿지 않아야 합니다. 따라서 이소플루란에 적신 물티슈를 투여를 위해 천공된 튜브에 넣습니다.
   2. 움직임과 호흡 노력의 중단과 발가락 꼬집음 반사의 부재로 사망을 확인합니다. 사망은 보통 방에 배치된 후 약 1-2분 정도 걸립니다.
      메모: 죽음은 보통 배뇨를 동반한다.
4. 발을 쭉 뻗은 상태로 해부 보드에 마우스를 누운 자세로 놓고 1인치 길이의 23게이지 주사기 바늘을 사용하여 발을 보드에 고정합니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 흉곽 바닥 부근의 털을 제거하고 뿌리에서 털을 자릅니다.
   메모: 해부 보드의 경우 폴리스티렌 쿨러 뚜껑을 사용할 수 있습니다.
5. 지혈기로 피부를 잡고 수술용 가위를 사용하여 흉곽 바닥 바로 아래 피부를 왼쪽 늑골궁에서 오른쪽 늑골궁까지 횡절개합니다(그림 1A).
6. 수술용 가위로 복막을 절개하고 횡격막에서 간을 조심스럽게 분리하되 과도한 출혈을 유발할 수 있는 간을 긁지 않도록 주의합니다(그림 1B). 흉강을 노출시키기 위해 흉부를 따라 횡격막을 절개합니다(그림 1C-D).
7. 수술용 가위를 사용하여 늑골 아치 가장자리에서 쇄골까지 흉곽의 측벽을 절단하여 심장을 노출시키고 심장이 손상되지 않도록 주의합니다(그림 1D). 그런 다음 23게이지 주사기 바늘을 사용하여 흉곽을 어깨에 걸고 제자리에 고정하여 수술 부위에 방해가 되지 않도록 합니다.
8. 전사 피펫을 사용하여 온난(37°C) 헤파린 처리된 Complete Tyrode 용액을 심장에 떨어뜨려 심장을 촉촉하게 유지합니다.
   메모: 심장이 건조해지지 않도록 하십시오.
9. 매우 가는 Graefe 집게로 폐를 잡고 수술 가위로 기관을 절단하여 폐를 제거합니다(그림 1E).
10. 매우 가는 Graefe 겸자로 심장의 정점을 잡고 수술 가위로 대동맥과 대정맥을 절단하여 제거합니다. 경화된 실리콘 엘라스토머가 함유된 페트리 접시에 심장을 옮기고(그림 2A) 전사 피펫을 사용하여 2-3mL의 따뜻한 (37°C) 헤파린 처리된 Complete Tyrode 용액으로 심장을 목욕시킵니다.
    메모: SAN을 포함하는 우심방의 섬세한 후벽과 연결된 우심방정맥이 손상되지 않도록 주의하십시오. Complete Tyrode의 용액으로 심장을 목욕시키면 심장이 건조해지는 것을 방지할 수 있지만 해부 시 시야를 손상시킬 수 있으므로 심장을 용액에 완전히 담그지 마십시오.
11. 실험자의 오른쪽에 오른쪽 심방이 있고 실험자의 왼쪽에 왼쪽 심방이 오도록 심장의 방향을 지정합니다.
    메모: 허혈 관련 부상을 방지하기 위해 SAN 조직의 절제는 신속하게 이루어져야 합니다.
12. 해부 핀으로 심장의 정점을 접시에 부착합니다. 그런 다음, Dumont #2 후정맥 절제술로 하대정맥을 잡고 22G 주사기 바늘을 하대정맥과 상대정맥을 통해 22G 주사기 바늘을 삽입하여 우측 심방에서 위치를 찾고, SAN의 대략적인 위치(하대정맥과 상대정맥 사이의 조직 패치에 위치)를 식별합니다(그림 2B).
13. 작은 해부 핀을 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 심방 부속물을 접시에 고정합니다.
    1. Dumont #2 후방 절제술로 좌심방 부속기를 잡고 좌심방 부속기에 박리 핀을 삽입하여 제자리에 고정합니다.
    2. Dumont #55 겸자로 우심방 부속기를 잡고 우심방 부속기에 박리 핀을 넣어 제자리에 고정합니다.
       메모: 원하는 경우 동일한 유형의 겸자를 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 심방 기관을 잡을 수 있습니다.
14. 대정맥 강낭에 걸쳐있는 주사기 바늘을 제거합니다.
15. 심장에서 혈액을 방출하려면 Castroviejo 가위를 사용하여 심실을 가로질러 가로 절개를 만들어 심장의 정점(즉, 아래쪽 절반)을 제거합니다(그림 2C). 그런 다음 전사 피펫으로 따뜻한(37°C) 헤파린 처리된 Complete Tyrode 용액을 추가하여 심장을 세척합니다.
16. Castroviejo 가위를 사용하여 절개 부위를 심방보다 심실에 더 가깝게 유지하면서 방실 중격을 따라 자릅니다. 심방이 심실에서 분리될 때까지 방실 중격을 따라 계속 절단합니다.
17. 좌심방을 제거하기 위해 심방간 중격을 따라 자릅니다.
18. 우심방 주변에 해부 핀을 배치하여 평평하게 놓습니다(그림 2D). Castroviejo 가위를 사용하여 아트리움에 남아 있는 지방, 혈관 또는 조직을 제거합니다.
19. 이 방향에서 상대정맥(위쪽), 아래쪽 대정맥(아래쪽) 및 cristae terminalis(왼쪽)와 대략 접해 있는 오른쪽 심방에서 SAN을 찾습니다(그림 2D).
    참고: crista terminalis는 우심방 부속기와 SAN 사이의 어두운 근육 융기로 나타납니다. 종종 SAN 동맥이 SAN을 통해 흐르는 것을 볼 수도 있습니다(그림 2D).

결과

그림 1: 심장 제거.(A) 왼쪽 늑골궁 부근에서 오른쪽 늑골궁까지 흉곽 바닥 바로 아래 피부의 횡단 절개.(B) 복막 절개. (C,D) 흉강을 노출시키기 위해 흉부를 따라 횡격막을 절개합니다. (E) 폐 절제 후 심장 제거.

그림 2: 동방(SAN) 노드의 해부.(A) 신체에서 꺼낸 후 페트리 접시에 있는 심...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
22 게이지 주사기 바늘	피셔 사이언티픽	14-826-5ᅡ	해부에 사용
23 게이지 주사기 바늘	피셔 사이언티픽	14-826-6씨	해부에 사용
60mm 페트리 접시	제네시 사이언티픽	32-105지
Castroviejo 가위, 4 "	정밀 과학 도구	15024-10
해부 현미경	젠코
해부 핀	정밀 과학 도구	26002-20
Dumont #2 후판 절제술 겸자	정밀 과학 도구	11223-20
Dumont #55 집게	정밀 과학 도구	11295-51
매우 미세한 Graefe 집게	정밀 과학 도구	제11152-10
헤모스탯	정밀 과학 도구	13013-14
덤플링을	Aurobindo Pharma Limited IDA, 파샤밀라람	재질 보기 NDC 63739-953-25
Sylgruard 엘라스토머 키트	다우코닝	184 SIL ELAST 키트 0.5KG
외과 용 가위	정밀 과학 도구	14074-09
트랜스퍼 피펫 (3mL 눈금)	(주)삼코사이언티픽	225
이소플루란	패터슨 수의학	TEL.07-893-1389

년 년 년 년 호 년 년 의