마우스 모델의 연속 약물 주입 시스템: 지속적인 약물 전달을 위해 마우스 뇌에 미세삼투압 펌프 주입 시스템을 이식하는 수술 절차

초록

출처: Ajoy, R., Chou, S. Y. 마우스 뇌에 지속적인 약물 주입 시스템을 사용하여 말초 포도당 불내성에 대한 시상하부 인슐린 신호 연구. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서는 미세삼투압 펌프 뇌 주입 시스템을 조립한 후 쥐의 두개골에 외과적으로 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 잠재적인 약물의 지속적인 전달을 가능하게 하고 뇌와 뇌 조직에 미치는 영향에 대한 연구를 용이하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Micro-Osmotic Pump 주입 시스템의 준비

참고: 0.2μm 필터로 여과된 완충액을 사용하여 펌프, 인공 뇌척수액(aCSF) 완충액 및 약물(Met-CCL5/RANTES 단백질 용액(aCSF에서 10ng/mL))을 멸균 조건에서 준비하고 장갑을 낀 채 배양 후드 아래에서 모든 절차를 수행합니다. 수술 절차는 다음과 같이 진행됩니다.

1. 수술 하루 전에 미세삼투압 펌프를 준비합니다: 키트와 함께 제공된 1mL 주사기 및 둔탁 바늘로 뇌 미세삼투압 펌프에 인공 뇌척수액(aCSF)을 채웁니다. 미세삼투압 펌프를 CSF에 담그고 셰이커에 올려 놓고 밤새 부드럽게 흔듭니다.
   주의 : 펌프는 CSF로 채워져야 하며 펌프 내부의 기포는 피해야 합니다(그림 1A).
2. 수술을 시작하기 전에 실험에 사용할 재조합 Met-CCL5/RANTES 단백질 용액(10ng/mL, aCSF로 희석)을 준비합니다. 펌프에서 aCSF를 제거하고 초과분이 누출될 때까지 약물 용액을 펌프에 천천히 채웁니다.
   참고: 15mL aCSF 또는 Met-CCL5/RANTES 용액은 5-8개의 펌프에 충분합니다.
   주의 : 절차를 반복하여 펌프가 내부에 기포 없이 약물로 완전히 채워졌는지 확인하십시오.
3. 카테터 튜브를 원하는 길이로 자르고 뇌 주입 키트에 있는 뭉툭한 끝의 뇌 주입 바늘로 부착합니다. 주입 키트와 튜브에 약물을 채웁니다.
4. 마지막으로 뇌 주입 키트를 조립하여 미세 삼투압 펌프에 부착합니다.
   주의 : 튜브나 펌프에 기포가 형성되어서는 안 됩니다(그림 1A).
5. 펌프가 마르는 것을 방지하기 위해 멸균된 50mL 튜브에 aCSF에 설정된 전체 삼투압 펌프-뇌 융합 세트를 담그십시오. 삼투압 펌프-뇌 융합 세트는 이제 수술에 사용할 준비가 되었습니다.
   참고: 미삼투압 펌프 시스템은 장기 약물 주입에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 안전하고 편리하게 약물을 쥐의 뇌로 전달할 수 있습니다.

2. 뇌내심실 수술 – 마이크로 삼투압 펌프의 이식

주의: 75% 에탄올로 수술 환경을 살균하고 연구에 참여한 사람들이 멸균 장갑과 깨끗한 실험실 가운을 착용하고 있는지 확인하십시오. 수술 도구/기구는 사용하기 전에 고압멸균 및 건조해야 하며, 이후 마우스 수술 사이에 75% 에탄올로 멸균해야 합니다.

1. 마우스의 무게를 측정하고 케타민/자일라진(케타민 50mg/kg, 자일라진 10mg/kg)과 함께 복강내 주사(IP)를 사용하여 마우스의 무게를 측정하고 마취합니다.
   주의: 생쥐의 체중이 24g 미만인 경우 삼투압 펌프 이식 수술에 권장되지 않습니다.
2. 마우스 헤드를 정위 장치에 장착하고 고정합니다(그림 1B).
3. 수술용 가위와 집게를 사용하여 두개골을 덮고 있는 바깥쪽 피부를 잘라냅니다. 요오드를 사용하여 주변 두개골을 청소합니다.
4. 삼투압 펌프-뇌 융합 세트 이식을 위해 목 부위 근처에 있는 한 쌍의 뭉툭한 머리 집게를 사용하여 피부의 가장 바깥쪽 층과 피하 피부층을 분리합니다(그림 1C).
5. 정위 장치를 사용하여 뇌 지도(그림 1D)를 참조하여 주입 지점을 표시합니다. 이 실험에서 바늘은 3^번째 뇌실 영역(브레그마: 측면 0.0mm, 후방 1.3mm, 복부 5.7mm)에 이식되어야 합니다.
6. 못 드릴을 사용하여 두개골에 표시된 영역 주위에 구멍을 뚫습니다(그림 1E).
   주의: 쥐의 수막과 혈관이 끊어지지 않도록 주의하여 뇌의 미세 혈관이 파괴되지 않도록 하십시오.
7. aCSF(대조군) 또는 약물(Met-CCL5/RANTES 단백질 용액)이 포함된 미삼투압 펌프-뇌 융합 세트를 목 부위 뒤의 피부 아래에 놓고 천공된 구멍에 뇌 주입 바늘을 삽입하여 약물을 마우스 뇌에 주입합니다(그림 1E). 바늘은 수막을 관통하여 심실로 들어갑니다. 표면 둔감화 젤(그림 1F)을 사용하여 두개골에 바늘을 고정하고 접착제가 마를 때까지 1-2분 동안 기다립니다. 다음으로 바늘 상단의 돌출 부분을 잘라냅니다(그림 1G-H).
8. 조직 접착제를 사용하여 머리의 수술 상처를 치료합니다. 상처 위에 접착제 50μL를 바르고 피부의 양쪽을 함께 당긴 다음 피부가 밀봉될 때까지 30초 동안 유지합니다(그림 1I).
   주의: 수술 후 상처를 청소하려면 100% 알코올 패드를 사용하고 감염을 예방하려면 스트렙토마이신이 함유된 100ul 페니실린을 사용하십시오.알림: 마우스 피부는 흉터 조직을 형성하고 수술용 접착제를 투여한 후 며칠 안에 치유됩니다. 접착제의 가장 큰 장점은 피부 자극이나 염증을 유발할 수 있는 수술용 바늘을 피할 수 있다는 것입니다.
9. 따뜻한 접시(최대 37°C까지 가열)에 보관된 깨끗한 케이지에 마우스를 넣고 마우스가 마취 효과에서 회복될 때까지 기다립니다.
   주의 : 수술 후 생존 가능성을 높이려면 마우스의 체온을 유지하는 것이 중요합니다.
10. 일주일의 회복 기간이 지나면 생쥐는 구강 포도당 내성 검사(OGTT) 및 인슐린 내성 검사(ITT)와 같은 추가 실험을 할 준비가 됩니다.

결과

그림 1. 마우스의 삼투압 펌프 준비 및 이식 수술 절차. (A) 약물 용액이 관류된 뇌 주입 키트 및 펌프 제제. 빨간색 화살표는 카테터 튜브에 액체가 채워져 있음을 나타냅니다. (B) 마우스 헤드를 정위 장치에 고정하고 장착합니다. (C) 미세 삼투압 펌프-뇌 주입 세트의 이식을 위해 피부의 가장 바깥쪽 층을 피하 피부에서 분리합니다. 점선은 삼투압 펌프 임플란트의 위치를 나타냅니다. (D) 화살표는 주입 쪽을 나타냅니다. (E) 두개골에 표시된 부분 주위에 구멍을 뚫습니다. (F) 삼투압 펌프-뇌 주입 세트를 마우스 뒤쪽에 놓고 뇌 주입 바늘을 뚫린 구멍(대시 원)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Vetbond 티슈 접착제	3엠	#1049SB	마우스 머리의 병변 부위를 밀봉하는 데 사용되는 접착제
LOCTITE® 454 순간 접착제	듀렉트 코퍼레이션	#의 8670	쥐의 두개골에 바늘을 고정하는 데 사용되는 접착제입니다.
Alzet Micro- 삼투압 펌프	듀렉트 코퍼레이션	#의 9922	시간당 0.11μl, 28일
뇌 주입 시스템	듀렉트 코퍼레이션	#의 8851	1-3 mm, 쥐 두뇌에 약을 안으로 관류하기 위하여 이용되는
MIO NE116 CONTROL UNIT (네일 드릴)	미오 시스템	#E235-015	마우스의 두개골에 구멍을 뚫으려면
aCSF 공식	119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM 포도당		필터는 0.22μm 필터 장치로 멸균하고 4°C에서 보관합니다. aCSF는 3-4주 동안 안정적입니다

.