Intravital Imaging: 안정화된 이미징 창을 통해 마우스 췌장의 세포 수준을 관찰하는 방법

Abstract

출처: Park, I. and Kim, P. 췌장 생체 내 이미징 창을 사용한 쥐 모델에서 췌장의 안정화된 종단 내 세포 수준 시각화. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 세포 역학의 장기적인 시각화를 위해 안정화된 창을 통해 쥐 췌장의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 생체 내 이미징

1. 레이저 출력을 포함한 생체 내 현미경을 켭니다.
2. 가열 패드를 켜고 항상열 조절을 37°C.
   로 설정합니다. 메모: 또는 수동 가열 패드 또는 램프를 사용하여 항상열 조절이 없는 경우 자주 제어하십시오.
3. 미리 이식된 췌장 창이 있는 마우스를 예로 들어 보겠습니다. 틸레타민/졸라제팜(30mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)의 혼합물로 근육 마취를 수행합니다.
   메모: 케타민 대신 틸레타민/졸라제팜을 사용하는 것이 좋으며, 이는 고혈당증의 부작용 때문에 권장됩니다. 실험의 목적에 맞는 최적의 마취를 선택해야 합니다.
4. 주사를 위해 혈관 카테터를 삽입합니다.
   1. 지혈대 적용의 대안으로 검지와 세 번째 손가락으로 꼬리의 근위부에 압력을 가합니다. 램프로 꼬리를 가열하십시오.amp 필요한 경우.
   2. 70% 에탄올 스프레이로 꼬리 정맥을 살균합니다.
   3. 30G의 카테터를 측면 꼬리 정맥에 삽입합니다. 혈액의 역류는 PE10 튜브에서 시각화됩니다.
   4. 카테터에 실크 테이프를 붙여 고정시킵니다.
   5. 형광 프로브의 조합에 따라 적절하게 FITC/TMR 덱스트란 또는 기타 형광 프로브(Alexa 647과 결합된 25μg의 anti-CD31)를 주입합니다.
      메모: 형광 접합 항체 프로브의 경우, 이미징 세션 2시간 전에 주입합니다.
5. 수술 플랫폼에서 이미징 스테이지로 마우스를 옮깁니다.
6. 직장 프로브를 삽입하면 동온성 발열 패드 시스템으로 체온을 자동으로 조절할 수 있습니다.
7. 췌장 이미징 창을 생체 내 현미경 검사 설정 중에 준비된 창 홀더에 삽입합니다(그림 1). 도립 현미경의 경우 창 홀더가 필요하지 않을 수 있습니다.
8. 생체 내 이미징을 수행합니다.
   1. 췌장 이미징을 위해 저배율 대물 렌즈(예: 4x)로 시작하여 췌장 이미징 창에서 췌장의 전체 보기를 스캔합니다(권장 시야: 2500 x 2500μm).
   2. 관심 영역을 결정한 후 고배율 대물 렌즈(20x 또는 40x)로 전환하여 세포 수준 이미징을 수행합니다(권장 시야: 500 x 500 μm 또는 250 x 250 μm). 이 실험에서 측면 및 축 방향 해상도는 각각 약 0.5μm 및 3μm였습니다.
   3. z-stack 또는 타임랩스 이미징을 수행하여 3D 구조 또는 세포 이동과 같은 세포 수준 역학을 관찰합니다.
      메모: 형질전환 동물(MIP-GFP)의 형광 단백질 발현 세포 이미징의 경우, 최대 0.43mW의 출력으로 30초 동안 간헐적인 488nm 레이저 노출을 견딜 수 있었으며, 눈에 띄는 광표백이나 조직 손상 없이 견딜 수 있었습니다. Alexa 647로 표지된 형광 단백질을 이미징하기 위해 최대 0.17mW의 640nm 레이저 출력은 눈에 띄는 광표백이나 조직 손상 없이 견딜 수 있었습니다. 이 설정보다 높은 출력으로 여기 레이저에 장기간 노출되면 광독성에 의한 광표백 또는 조직 손상이 발생할 수 있습니다. 관심 영역을 적절하게 이미지화할 수 있도록 적절한 게인과 파워를 조정합니다. 생체 내 현미경 검사에서 매개변수의 세부 설정은 연구소에서 준비된 각 생체 내 현미경 검사에 대해 개별화되어야 합니다.

Results

그림 1: 췌장 생체 내 이미징 창의 구현 사진.췌장 생체 내 이미징 창은 XYZ 번역 단계에서 마우스에 이식되고 틸팅 마운트에 부착된 이미징 챔버 홀더는 췌장 이미징 창에 연결됩니다. Copyright 2020 대한당뇨병학회 당뇨병 Metab J. 2020 44:1:193-198. 대한당뇨병협회의 허가를 받아 재인쇄함.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 숙시니미딜 에스테르(NHS 에스테르)	인비트로젠	A20006	항체와 접합체를 위한 형광 프로브
BD Intramedic 폴리에틸렌 튜빙	BD 바이오사이언스	427401	바늘 연결용 PE10 카테터
C57BL/6엔	오리엔트바이오	C57BL/6엔	C57BL/6엔
커버 안경 원형	마리엔펠트	0111520	췌장 이미징 창용 커버 유리
FITC 덱스트란 2MDa	머크(전 시그마 알드리치)	FD200S	선박 식별용
이마리스 8.1	비트플레인	이마리스	이미지 처리
Intravital 현미경 검사	IVIM 기술	IVM-씨	Intravital 현미경 검사
밉치-GFP	잭슨 연구소	006864	나6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1하라/J
췌장 이미징 창	금토엔지니어링	맞춤 주문	췌장 이미징 창 - 사용자 정의 주문
피지오스위트	켄트 사이언티픽	추신-02	Homeothermic 온도 조절기
TMR 덱스트란 65-85kDa	머크(전 시그마 알드리치)	T1162	선박 식별용
윈도우 홀더	금토엔지니어링	맞춤 주문	창문 홀더 - 맞춤 주문
졸레틸	버박	졸레틸 100	마취제
롬푼	바이엘	롬푼	마취제