Antegrade Perfusion Model: 고립된 마우스 심장을 관류하는 생체 외 기술

초록

출처: Omatsu-Kanbe, M. et al., 생쥐에서 심근세포 분리를 위한 사전 관류 방법. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 고립된 쥐 심장의 전단계 관류 기술에 대해 설명하며, 그 동안 관류액이 좌심실을 통해 주입되고 최종적으로 전체 심근을 관류합니다. 이 방법은 쥐 모델에서 심근세포를 분리하고 추가 다운스트림 응용 프로그램을 위해 탈세포화된 심장을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 심장의 사전 관류

참고: 심장을 빨아들이는 데 사용되는 플라스틱 이송 피펫은 부드러워야 하며 끝을 향해 날카롭게 가늘어지지 않아야 합니다. 톱니가 있는 작은 혈관 클램프를 선택하십시오. 권장 기기는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 마우스 심장 절제 및 대동맥 조임
   메모: 성체 마우스(>8주령)는 펜토바르비탈나트륨(>300mg/kg, 복강내[ip] 주사)과 헤파린(8000단위/kg)을 과다 투여하여 안락사시켜야 합니다.
   1. 빨아서 쥐의 심장을 빠르게 절제하십시오.
      1. 흉강을 빠르게 열어 심장을 노출시킵니다. 끝이 노출된 심장과 거의 같거나 약간 작은 플라스틱 전사 피펫을 자릅니다(일반적으로 0.5mL 표시에서 팁 방향으로 약 1cm 떨어진 부위이지만 심장 크기에 따라 다름).
      2. 심장을 피펫으로 빨아들이고, 가위를 넣을 수 있는 충분한 공간을 만들기 위해 피펫을 올리고, 심방이 손상되지 않도록 등쪽에서 구부러진 가위로 심장을 절제합니다.
      3. 절제된 심장을 얼음으로 냉각된 CIB-EGTA가 들어 있는 30mL 유리 비커로 즉시 옮겨 수축을 멈춥니다. 이 절차는 일반적으로 <1분 정도 걸립니다.
   2. 대동맥 주변 청소
      1. 얼음으로 식힌 CIB-EGTA를 채운 35mm 배양 접시에 심장을 옮기고 폐 및 기타 눈에 보이는 조직을 제거한 다음 거칠게 세척한 심장을 식힌 CIB-EGTA로 채워진 심장 스탠드로 옮기고 정점이 아래로 향하게 놓습니다.
      2. 실체 현미경으로 지방과 결합 조직을 제거하여 대동맥 주변을 청소합니다. 절단된 대동맥의 길이가 상완두동맥, 좌측 총경동맥 또는 좌측 쇄골하 동맥을 포함하여 너무 길면 다음 단계로 진행하기 위해 상완두동맥 바로 아래의 대동맥을 잘라 짧게 합니다. 이 절차는 일반적으로 약 4분 정도 걸립니다
   3. 대동맥을 고정하고 클램핑된 심장을 관류 플레이트에 놓습니다.
      1. 주사 바늘을 삽입하고 관류를 시작하여 혈액을 배출합니다.
         1. 현미경 아래에서 심장을 심장 스탠드에 놓습니다. 시술자는 심장의 앞쪽 표면을 향하고 핀셋으로 대동맥 끝을 집어 올리고 대동맥을 약간 부드럽게 누르면서 작은 혈관 클램프로 심방 근처의 대동맥을 고정해야 합니다.
         2. 클램프된 심장을 앞쪽이 위로 향하게 하여 관류 플레이트에 놓고 CIB-EGTA 몇 방울로 덮어 건조되지 않도록 합니다. 이 절차는 일반적으로 <20초가 걸립니다.
      2. 심장의 전행성 관류
         메모: 먼저 CIB-EGTA를 심장에 관류하여 혈액을 배출하고 응고를 방지합니다.
         1. 주사 바늘을 삽입하고 관류를 시작하여 혈액을 배출합니다.
            1. 예열된 CIB-EGTA로 채워진 20mL 주사기를 유연한 확장 튜브에 연결하고 주입 펌프에 표시된 주사 바늘을 놓습니다. 0.5mL/분의 느린 속도로 펌프를 시작하여 바늘과 튜브에 CIB-EGTA를 조심스럽게 채우고 튜브에 공기가 들어가지 않도록 합니다.
            2. 주사 바늘을 대각선 모양의 짧은 면이 앞에 오도록 관류 플레이트에 놓습니다. 바늘이 심장 꼭대기에 닿을 때까지 바늘을 밀어 넣은 다음 좌심실 정점 근처의 바늘을 비틀지 않고 심실실에 조심스럽게 삽입합니다. 삽입을 수행하는 동안 플레이트에서 바늘을 분리하지 마십시오.
            3. 바늘 삽입의 깊이를 추정하려면 빨간색 표시를 관찰하십시오. 바늘 삽입이 완료되면 관상 동맥에서 흐르는 혈액이 배출되기 시작해야 합니다.
            4. 테이프로 플레이트에 주사 바늘을 고정하고 펌프 속도를 1mL/분으로 높입니다. 이 절차는 일반적으로 약 30초 정도 걸립니다. 심장이 성공적으로 관류되면 외막 바로 아래 모세혈관에서 CIB-EGTA의 흐름을 현미경으로 볼 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
확장 튜브	Top, 일본	1-50	주사기와 주사 바늘로 연결하여 사전 관류를 제공합니다.
히터 매트	Natsume Seisakusho, 일본	KN-475-3-40	관류 플레이트를 데우는 장비.
주입 펌프	TERUMO, 일본	테-311	사전 관류를 위한 주입 주사기 펌프.
주사 바늘 (27 게이지)	TERUMO, 일본	NN-2719S	좌심실에 삽입하기 위한 바늘.
인슐린(소 췌장에서 추출)	Sigma-Aldrich, 미국	I5500	0.1M HCl에 용해합니다.
플라스틱 주사기(20mL)	TERUMO, 일본	친위대-20ES	CIB-EGTA 주입에 사용합니다.
혈관 클램프	Karl Hammacher GmbH, 독일	HSE 004-35	대동맥을 클램핑하는 데 사용되는 작은 직선 혈관 클램프.
다른 모든 시약	Nacalai Tesque, 일본

개 (영문)