Isolated Murine Pulmonary Valve의 압력 고정: 마우스 폐동맥 판막을 폐쇄된 형태로 격리하고 화학적으로 고정하는 절차

초록

출처: Liu, Y., et al. 쥐 폐동맥 판막의 상관 이미징을 위한 수술 및 샘플 처리. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오에서는 관류 가압을 통해 마우스 폐값을 폐쇄 형태로 분리하고 화학적으로 고정하는 절차를 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 폐동맥 판막 절제

1. 마우스 해부에 필요한 도구를 오토클레이브합니다. 여기에는 가는 가위, 마이크로 집게, 마이크로 혈관 클램프, 집게 적용 클램프, 마이크로 니들 홀더, 스프링 가위 및 견인기가 포함됩니다.
2. 수술 전 최소 2주 동안 모든 마우스를 적응시킵니다. 약 1세의 C57BL/6 쥐를 케이지에서 꺼내 무게를 잰 다음 케타민/자일라진 칵테일(3:1 케타민:자일라진, g당 0.01mL)을 과다 투여하여 안락사시킵니다.
3. 마우스를 트레이에 등쪽 누운 자세로 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 고정되면 개흉술을 시행합니다.
   1. 과도한 지방 조직과 근막을 제거하여 심장을 노출시킵니다.
   2. 우심방을 제거하고 좌심실을 통해 실온의 식염수(0.9% NaCl)로 관류합니다. 관류는 30초 동안 약 20mL가 소요되어야 합니다. 이것은 마우스의 출혈을 초래합니다.
4. 상대정맥, 하대정맥, 폐동맥, 대동맥을 절단하여 심장 전체를 제거합니다. 폐동맥은 특별한 주의를 기울여야 합니다. 심실-동맥 접합부 위로 약 2mm 정도 자르면 가압을 위한 도관 역할을 합니다.
5. 좌심실과 우심실을 제거하여 챔버를 대기압에 노출시킵니다. 폐동맥의 구조가 심실 제거에 의해 영향을 받지 않아야 합니다.

2. 폐동맥 판막의 압력 고정

1. 폐동맥이 있는 아나스토모스 가압 튜브, 소엽과 폐 줄기의 큰 움직임을 수용하기 위해 중관형 접합부와 튜브 끝 사이에 약 1mm 거리를 둡니다.
2. 저장소를 유사한 생리적 압력으로 올리고 식염수로 채웁니다. 플로우 스루 시스템을 테스트하여 막힘이나 기포가 없는지 확인합니다.
3. 문합된 폐동맥 판막에 마개를 부착하고 유출로를 전환하여 튜브를 통한 적절한 흐름(즉, 기포 없음)을 보장합니다. 흐름이 적절해지면 문합된 폐동맥 판막으로 유출을 전환하고 폐동맥 줄기의 가압을 보장합니다. 이것은 폐동 팽창(pulmonary trunk extention)으로 확인됩니다.
4. 폐동맥 줄기의 가압이 확인되면 식염수가 퍼지될 때까지 1차 고착액(1.25% 글루타르알데히드, 0.15M 카코딜레이트 중 1.0% 파라포름알데히드)을 점차적으로 통합합니다. 이는 식염수 저장 용량의 약 25%에 해당하는 부분을 제거하고 1차 고정제로 교체함으로써 수행됩니다.
   주의: 사용되는 고정제(파라포름알데히드 및 글루타르알데히드)는 독성이 높으므로 안전을 위해 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다.
5. 건조를 방지하기 위해 조직 샘플 위에 고정제를 적신 거즈를 놓습니다.
6. 정착물을 3시간 동안 관류하고 일정한 압력을 유지하기 위해 필요에 따라 저장소를 다시 채웁니다. 고정 전반에 걸쳐 화학적 고정으로 인해 폐 판막이 수축하는 것은 드문 일이 아닙니다. 이 경우 생리적 압력을 유지하기 위해 1차 정착제를 저장소에 지속적으로 보충하십시오.
7. 심장 판막을 4°C의 고정액에 넣어 사용할 때까지 보관하십시오. 샘플은 눈에 띄는 차이 없이 최대 1주일 동안 보관되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
25% 글루타르알데히드(aq)	EMS (엠에스)	16210	1차 고착 성분
0.9% 염화나트륨 주입	주식회사 호스피라	국토교통감사원 0409-4888-10
1mL 주사기	BD (영어)	309659
10mL 주사기	BD (영어)	309604
22G 바늘	BD (영어)	305156
3방향 스톱콕	스미스 메디컬 ASD, Inc	MX5311L
4% 파라포름알데히드(AQ)	EMS (엠에스)	157-4-100	1차 고착 성분
C57BL/6 마우스	잭슨 연구소	664	약 1 세
집게를 적용하는 클램프	증권 시세	제00072-14
뒤몽 #5 집게	증권 시세	11251-20
Dumont #5/45 겸자	증권 시세	11251-35
Dumont #7 파인 펜셉	증권 시세	11274-20
파인 가위	증권 시세	14028-10
식염수(멸균 0.9% 염화나트륨)	호스피라 Inc	국회 0409-0138-22
수술용 현미경	라이카	M80
티쉬 바늘 홀더/집게	마이크린	MI1540
트리머	왈	9854-500
블랙 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사, 10-0	ARO수술 기구 주식회사	TI38402
블랙 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사, 6-0	ARO수술 기구 주식회사	SN-1956
케타민 염산염 주사	호스피라 Inc	노스다큐멘터리 0409-2053
L-아스파르트산	시그마-알드리치	56-84-8	염색 성분
질산납	EMS (엠에스)	17900	염색 성분
나트륨 cacodylate trihydrate	시그마-알드리치	6131-99-3	완충기
부직포 노래	맥케슨 주식회사	94442000
마이크로 아드슨 집게	증권 시세	11018-12
Millex-GP 필터, 0.22 um, PES 33mm, 비멸균	EMD 밀리포어	SLGP033NS

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