새끼 쥐의 백색 및 갈색 지방 창고 수집: 새끼 쥐에서 백색 지방 조직과 갈색 지방 조직을 채취하는 수술 절차

초록

출처: Galmozzi, A. et al. Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice. J. Vis. 특급 (2021)

이 비디오에서는 신생아 마우스에서 피하 백색 지방 조직과 견갑골 간 갈색 지방 조직을 분리하는 수술 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 지방 저장소의 수집 및 소화(1일차)

1. 각 강아지에 대해 두 개의 1.5mL 튜브를 준비합니다: 하나는 갈색 지방 조직(BAT)용이고 다른 하나는 백색 지방 조직(WAT)용입니다. 각 튜브에 250μL의 인산염 완충 식염수(PBS) + 2x 분리 완충액 200μL(123mM NaCl, 5mM KCl, 1.3mM CaCl₂, 5mM 포도당, 100mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 페니실린-스트렙토마이신 및 4% 지방산이 없는 소 혈청 알부민)을 추가합니다. 용액을 멸균 상태로 얼음 위에 보관하십시오.
2. 강아지를 작은 방(예: 6웰 플레이트의 우물 1개)에 넣고 저체온이 될 때까지 얼음 위에 놓습니다. 강아지와 얼음 사이에 직접적인 접촉이 없는지 확인하십시오. 의식을 잃을 수 있도록 팁으로 발을 찌르고 날카로운 가위를 사용하여 참수하여 강아지를 안락사시킵니다.
   참고: 다른 유전자형으로 작업하는 경우 유전형 분석을 위해 꼬리 생검(3mm 절단)을 수집하기 위해 추가 튜브를 준비하십시오. 유전형 분석이 즉시 수행되는 경우 안락사된 새끼를 해부할 때까지 얼음 위에 두어 지방 저장소를 수집합니다.
3. 모든 저장소를 소화하는 데 필요한 콜라겐 분해 효소의 양을 계산하고 무게를 잰다. 각 튜브에 2x 분리 버퍼에 50μL의 15mg/mL 콜라겐분해효소 I형을 추가합니다. 모든 조직이 수집될 때까지 콜라겐분해효소를 분리 완충액에 재현탁하지 마십시오.
4. 피하 WAT를 수집하려면 강아지의 복부 주변 피부를 자르고(복막 파열을 피함) 다리 아래 피부를 부드럽게 아래로 당깁니다. 피부를 채취하지 않고 대퇴사두근 내부 또는 상단에 부착된 투명(P1 이하) 또는 흰색(P2 이상) 얇고 길쭉한 조직으로 나타나는 지방 저장소를 조심스럽게 수집합니다(그림 1A, B). 팻 디포를 PBS로 헹구고 250μL의 PBS + 200μL의 2x 분리 버퍼가 들어 있는 튜브 중 하나에 넣습니다. 얼음에 보관하세요.
   참고: P0 및 P1 마우스가 최상의 수율을 제공합니다. P0-1 새끼에서 피하 WAT 저장소는 거의 투명합니다. P2 이상의 마우스에서는 디포가 이미 흰색으로 변하고 있기 때문에 식별하기가 더 쉬우며, 이는 완전히 성숙하고 지질이 적재된 백색 지방 세포의 존재를 나타냅니다.
5. 견갑골 박쥐를 모으려면 견갑골의 피부를 머리 위로 당깁니다. 견갑골 사이의 짙은 붉은 조직인 BAT를 들어 올리고 조심스럽게 주위를 절개하여 몸에서 분리합니다(그림 1A, B). 일관성과 색상을 확인하십시오. PBS로 헹굽니다. 250 μL의 PBS + 200 μL의 2x 분리 버퍼가 들어있는 다른 튜브에 넣습니다. 그리고 얼음에 계속하십시오.
   참고: P2 이상의 마우스에서 BAT를 채취할 때는 BAT를 둘러싼 백색 지방 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 피부와 BAT는 견갑골 사이 더 깊은 곳에 위치한 얇고 부드러운 흰색 지방 세포 시트로 구성됩니다.

결과

그림 1: 지방 패드의 수집 및 가공. (A) 1차 백색(위) 및 갈색(아래) 지방 세포 분리의 개략도. (B) 피하 백색(위) 및 갈색(아래) 지방 저장소. P0 마우스에서 피하 WAT는 거의 보이지 않지만 출생 후 ~2일째에 구별할 수 있습니다. 대조적으로, BAT는 P0에서도 뚜렷한 어두운 색을 가지고 있습니다. 나이가 많은 새끼의 경우 BAT는 WAT의 얇은 표재성으로 둘러싸여 있어 조직을 해부할 때 제거해야 합니다. (C) 100μm 세포 여과기를 통한 여과 후, 초기 세척 후, 분리 후 24시간 후의 1차 백색 및 갈색 전구체 세포의 대표 이미지. 스케일 바 = 100μm. 약어: WAT = 백색 지방 조직; BAT =...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 플레이트	코 닝	353046
지방산 무함유 BSA	시그마-알드리치	A8806
염화칼슘2	시그마-알드리치	C4901
포도당	시그마-알드리치	G7021
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
케이클	시그마-알드리치	P9333
염화나트륨	시그마-알드리치	S7653
펜/연쇄상구균	지브코	15140122
수술용 겸자	ROBOZ 수술 기구 Co	RS-5158
외과 용 가위	ROBOZ 수술 기구 Co	RS-5880
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	지브코	14190144

) (영문)