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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 재료 및 도구 준비
- 열 담요를 연결하여 마취 중 작업 영역의 온도와 마우스 체온을 37°C로 유지합니다.
- 오토클레이브 가위와 집게, 70% 에탄올 용액을 준비하고 사용 가능한 덱스판테놀 눈 연고, 면 여러 조각, 5-0 코팅 꼰 폴리에스터 봉합사를 사용할 수 있도록 준비합니다. 동물의 절개 부위를 촉촉하게 유지하기 위해 0.9% 식염수(바늘 제외)가 포함된 1mL 주사기를 준비합니다. 마취 가스 (100 % O2 + 이소 플루란)를 준비합니다.
- 10 μL 피펫 팁(길이 3-5 mm)의 끝을 절단하여 레이저 도플러 프로브용 홀더를 준비합니다.|
알림: 모든 기기는 핫 비드 살균기를 사용하여 멸균됩니다. 또한 수술 전후에 미생물 소독제 스프레이로 표면을 소독합니다. 수술 전에 생쥐의 머리와 가슴 주위를 상처 소독 스프레이로 소독합니다.
2. 레이저 도플러의 준비
- 수술 30분 전에 마우스에게 진통제를 주사합니다(4mg/kg 카프로펜 및 0,1mg/kg 부프레노르핀, 복강내).
- 자발적인 신체 움직임과 진동이 멈출 때까지 4%의 이소플루란 유속으로 마우스를 유도 챔버에 넣어 마취합니다.
- 마취 마스크에 코를 대고 수술 영역에서 마우스를 엎드린 자세로 놓습니다. 다시 1분 동안 이소플루란 농도를 4%로 유지한 다음 낮추고 2%로 유지합니다.
- 마우스 체온을 37°C로 유지하기 위해 관련 피드백 제어 발열 패드를 설정하고 직장 프로브를 부드럽게 삽입하여 수술 절차 전반에 걸쳐 온도를 모니터링합니다.
- 덱스판테놀 아이 연고를 양쪽 눈에 바르십시오.
- 왼쪽 눈과 귀를 둘러싼 피부와 모발을 70% 에탄올로 소독합니다.
- 왼쪽 귀와 눈 사이의 두피(1cm 길이)를 잘라 두개골 뼈를 드러냅니다.
- 두개골 아래의 MCA를 시각화하기 위해 측두근을 자르고 은퇴시킵니다.
- 왼쪽 MCA 위에 레이저 도플러 프로브/광섬유를 고정하는 팁의 바깥쪽 부분을 접착제로 고정합니다. 그런 다음 피부를 접착제로 발라 팁 홀더 주위의 상처를 봉합합니다. 경화제 접착제 2-3방울을 바르면 처리 속도가 빨라집니다. 레이저 도플러 섬유가 접착되지 않고 언제든지 팁 홀더에서 쉽게 제거할 수 있는지 확인하십시오.
3.Transient MCAo 모델(폐색)
- 마우스를 누운 위치로 돌립니다. 주둥이를 마취 원뿔에 넣고 테이프로 발을 고정합니다.
- 가슴 주위의 피부와 모발을 소독하고 목덜미를 2cm 길이의 정중선 절개를 합니다.
- 집게를 사용하여 피부와 턱밑샘을 분리하십시오. 견인기를 사용하여 흉골 유방근을 잡고 수술 영역을 노출시키고 왼쪽 총경동맥(CCA)을 찾습니다. 결합 조직과 주변 신경이 없는 CCA를 절개하고(미주신경에 해를 끼치지 않고) 분기 전에 일시적인 결찰을 수행합니다.
- 외부 경동맥(ECA)을 절개하고 가장 눈에 보이는 원위 부분에 영구적인 매듭을 묶습니다.분기점에 가까운 ECA 아래에 다른 봉합사를 놓고 나중에 사용할 느슨한 매듭을 준비합니다.
- 내부 경동맥(ICA)을 절개하고 분기점에서 5mm 떨어진 곳에 미세혈관 클립을 놓습니다. 미주신경이 손상되지 않도록 주의한다.
- 단단히 연결된 연결과 느슨한 연결 사이의 ECA에 작은 구멍을 뚫습니다. ECA 전체를 자르지 않도록 주의하십시오.
- 필라멘트를 도입하고 CCA 쪽으로 전진시킵니다. ECA의 느슨한 결찰을 내강 주위로 조여 필라멘트를 해당 위치에 잠시 고정하고 미세혈관 클립을 제거할 때 출혈을 방지합니다.
- 미세혈관 클립을 제거하고 레이저 도플러로 측정한 뇌 혈류의 급격한 감소(>80%)를 감지하여 MCA의 원점에 도달할 때까지 ICA를 통해 필라멘트를 삽입합니다. ECA 주위의 매듭을 더 조여 이 위치에서 필라멘트를 고정합니다.
메모: 필라멘트가 적절한 방향으로 이동하면 부드럽게 진행되며 저항이 관찰되지 않아야 합니다.
- 필라멘트 삽입 전후의 레이저 도플러 값을 기록합니다.
- 상처를 봉합하기 전에 견인기를 제거하고 흉골 유방근과 턱밑샘을 재배치합니다. 레이저 도플러 프로브를 제거하고 동물을 37°C의 회수 챔버에 1시간 동안 놓습니다(필라멘트가 제거될 때까지).