대장내시경 유도 쥐 상처 모델: 치유 과정을 이해하기 위해 결장에서 생검 유도 상처 침대를 분리하는 방법

초록

출처: Montrose, D. C., et al. 마우스에서 대장내시경 유도 핀치 생검 수행 및 후속 조직 변화 평가. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 상세한 분자 분석을 위해 적절한 시점에서 대장내시경으로 인한 상처 부위를 분리하는 절차를 설명합니다. 이 분석은 위장관의 염증성 상태에서 상처 치유 과정을 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 분자 분석을 위한 상처 부위 수집

1. 생검 후 선택한 날에 CO₂ 질식 후 자궁경부 탈구(또는 이에 상응하는 기술)를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.
2. 피부와 복부 근육을 열어 체강을 노출시켜 결장의 원위 부위를 채취합니다. 닫힌 가위를 결장 아래에 놓고 부드럽게 들어 올려 밑에 있는 장간막에서 분리한 다음 결장의 중간 지점과 항문에서 결장을 잘라 쥐에서 제거합니다.
3. 얼음처럼 차가운 1x PBS를 채운 20mL 주사기에 부착된 쥐 배설물 바늘을 사용하여 대변 함량을 씻어낸 다음 여과지에 결장을 놓습니다.
4. 여과지에서 결장을 세로로 잘라 장간막 면이 여과지에 대해 아래를 향하도록 합니다. 조직이 여과지에 있는 동안 스퀴즈 피펫을 사용하여 점막에 0.2% 메틸렌 블루를 바르고 여분의 메틸렌 블루를 배출합니다. 해부 현미경으로 결장을 보고 상처 부위를 찾습니다(그림 1A).
5. 4인치 마이크로 홍채 가위를 사용하여 근육층을 절단하지 않도록 주의하면서 상처 부위(그림 1A, 점선 원)의 가장자리를 자르고(근육이 필요하지 않은 경우) 절개된 상처 부위를 스냅 동결 또는 원하는 보관 방법을 위해 가는 핀셋을 사용하여 튜브로 옮깁니다.
   메모: 이러한 방식으로 수집된 조직의 양은 RNA-seq 또는 이와 동등한 분석을 위해 RNA를 추출하기에 충분합니다.

결과

그림 1 : 상처 침대의 생체 외 및 절편 이미지. (A) 생검 2일 후 마우스에서 결장을 채취하여 0.2% 메틸렌 블루로 염색하고 해부 현미경으로 이미지화했습니다. 점선 원은 상처 부위의 가장자리를 나타냅니다. 검은색 선은 절편을 위해 삽입하기 전에 상처 부위/결장을 이등분할 적절한 위치를 나타냅니다. (B) 상처 부위의 H&E 염색 부위의 대표 이미지. 별표는 상처 부위를 나타내고 화살표는 상처 부위에 인접한 손상되지 않은 소낭선을 나타내며 부상 부위의 경계를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
생검 겸자, 3 Fr	칼 스토르츠	61071ZJ
이소플루오란	코브트러스	2905
메틸렌 블루	시그마-알드리치	M9140
마이크로 아이리스 가위	인테그라	18-1619
#10 블레이드가 있는 스칼팔	언덕 - 롬	372610

년 년