근섬유 분리: 수확된 쥐 EDL(Extensor Digitorum Longus) 근육에서 단일 근섬유를 얻는 기술

초록

출처: Hüettner, S.S. et al. 생체 외 성인 근육 줄기 세포 기능 평가를 위한 단일 근섬유 배양 분석. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 수확된 쥐 EDL(Extensor Digitorum Longus) 근육에서 단일 근섬유를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 근섬유는 근섬유와 관련된 근육 줄기세포 활성을 연구하기 위해 배양할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. EDL 근육 분리 및 콜라겐분해효소 소화

1. 오염을 방지하기 위해 모든 장비에 70% 에탄올을 분사하십시오.
2. 동물 실험에 대한 국가 규정에 따라 마우스를 희생하십시오.
3. 마우스의 뒷다리에 70% 에탄올을 뿌립니다. 경화된 가는 곡선 가위(24mm 절삭날)와 가는 집게(Dumont 7, 곡선 또는 직선)를 사용하여 피부를 제거하고 기저 근육을 노출시킵니다. 밑에 있는 근육이 털과 접촉하지 않도록 하십시오(오염 위험 증가).
4. 기저 근육을 손상시키지 않고 미세한 곡선 집게로 주변 근막을 제거합니다(그림 1A). 구부러지지 않도록 집게를 닫으십시오.
5. 구부러진 집게를 사용하여 TA(경골 전방) 및 EDL 근육의 원위 힘줄을 노출시킵니다. TA를 제거하려면 집게로 원위 TA 힘줄을 잡고 가는 Vannas 스프링 가위(절단면 5mm, 팁 직경 0.35mm)로 자릅니다. TA를 힘줄에 대고 무릎 쪽으로 당기고 무릎에 가까운 근육을 자르면(그림 1B) EDL 근육이 노출됩니다.
   메모: 이 단계에서는 TA 힘줄만 잡아야 하며, 그렇지 않으면 기본 EDL이 손상될 수 있습니다. TA 근육을 절단할 때는 무릎의 힘줄이 나중에 쉽게 보이는지 확인하십시오.
6. 가늘고 구부러진 집게로 원위 EDL 힘줄을 들어 올리고 가느다란 Vannas 스프링 가위로 자릅니다(그림 1C). EDL을 무릎 쪽으로 조심스럽게 당겨 근위 EDL 힘줄을 노출시킵니다. 가는 Vannas 스프링 가위로 근위 힘줄을 자릅니다. EDL 근육을 15mL 반응 튜브에서 37°C로 예열된 2.5mL의 콜라겐분해효소 분해액으로 옮깁니다. 콜라겐 분해 효소 용액은 다음 절차에 따라 제조됩니다.
   1. 0.2%(w/v) 콜라겐분해효소 유형 1(클로스트리듐 히스톨리티쿰에서 추출)을 DMEM(4.5g/L 포도당 및 피루브산나트륨이 함유된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지)에 용해하고 0.22μm 필터를 통해 여과하여 콜라겐분해효소 분해 용액을 준비합니다. (그림 1D).
      메모: 근위 EDL 힘줄이 완전히 노출되도록 바깥쪽 무릎 결합 조직을 작게 절개합니다. 힘줄만 잡고 EDL을 너무 많이 늘리지 않도록 합니다.
7. 두 번째 EDL에 대해 1.3-1.6단계를 반복합니다. 2.5mL 콜라겐분해효소 분해 용액으로 채워진 동일한 15mL 반응 튜브에 두 EDL 근육을 추가합니다.
8. 순환 수조에서 37°C의 반응 튜브에 있는 EDL 근육을 배양합니다.
   메모: 배양 시간은 콜라겐 분해 효소 활성, 쥐의 나이 및 섬유화 조직의 양과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 성체 마우스(생후 2-6개월)의 EDL 근육의 일반적인 잠복기는 1-1.5시간이고 노화된 마우스(18개월)의 경우 1.5-2시간입니다.
9. 근육의 과도한 소화를 피하려면 소화 시간 동안 근육을 확인하십시오. 근육이 느슨해지고 단일 근섬유가 보이면 소화를 중지합니다(그림 1E). 큰 구멍 피펫을 사용하여 다음과 같이 준비된 근섬유 분리 매체(그림 1G)를 포함하는 예열된 12웰 플레이트의 첫 번째 웰로 근육을 조심스럽게 이동합니다.
   1. DMEM(4.5g/L 포도당 및 피루브산 나트륨이 함유된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지)에 20% FBS(소 태아 혈청)를 보충하고 0.22μm 필터를 통해 필터링합니다. 분리 약 30분 전에 사전 코팅된 분리 플레이트(12웰 플레이트, 웰당 2-4mL 분리 배지)에 배지를 추가하고 5% CO₂로 가습된 37°C 인큐베이터에서 평형을 이룹니다.

2. 근섬유 해리

1. 다음 단계에서는 가열판(37°C)이 우선적으로 장착된 실체 쌍안 현미경을 사용합니다. 큰 구멍 피펫을 사용하여 단일 근섬유가 방출될 때까지 따뜻한 격리 배지로 근육을 씻어냅니다. 원하는 수의 근섬유가 용액에서 자유롭게 떠다닐 때까지 큰 구멍 피펫으로 근육을 분리하십시오.
   메모: 손상된 근섬유의 위험을 줄이기 위해 과도한 분쇄를 피하십시오. 분리 과정에서 온도가 떨어지면 근섬유 사멸을 초래할 수 있으므로 근섬유 해리를 위해 가열판을 사용하는 것이 좋습니다.

결과

그림 1. 마우스 EDL 해부 및 단일 근섬유 분리.(A) 쥐 뒷다리의 피부를 제거하고 근막을 둘러싼 근육을 당겨 TA(경골 전방) 근육을 노출시킵니다. (B) TA 근육을 제거하여 흰색 화살표로 표시된 EDL(extensor digitorum longus) 근육을 노출시킵니다. (C) EDL 근육은 힘줄을 절단하여 절개합니다. (D) 두 개의 EDL 근육은 콜라겐 분해 효소입니다. (E) 조직 코어에서 느슨해지는 눈에 보이는 단일 근섬유와 함께 콜라겐분해효소 소화 근육의 모양. (F

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐분해효소 유형 1	시그마	C0130
DMEM(4.5g/l 포도당과 피루브산 나트륨을 함유한 Dulbecco의 변형 독수리 배지)	지브코	41966029	세포 배양 배지
소 태아 세럼	지브코	10270-106	소 태아 세럼

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