세균성 안구내염 마우스 모델: 세균성 안구내염을 마우스의 눈에 유리체강내 주입하여 세균성 안구내염을 생성하는 방법

초록

출처: Mursalin, M. H. et al., 세균성 안구염의 마우스 모델에서 감염 매개변수의 유리체 내 주입 및 정량화. J. Vis. 특급. (2021).

이 비디오는 세균성 안구내염(세균이 눈의 유리체강으로 침입하여 발생하는 안구 내 감염)을 모방한 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 마우스 모델은 질병 메커니즘을 연구하고 이에 대한 치료법을 평가하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 멸균 유리 바늘

1. 니들 피펫 풀러를 켭니다.
2. 디스플레이에 12.6이 표시될 때까지 히터 손잡이를 조정합니다.
3. 도어를 열고 튜브의 절반이 필라멘트 아래로 확장될 때까지 상단 클램프와 히터 필라멘트를 통해 5μL 모세관 튜브를 수동으로 공급합니다(그림 1A).
4. 모세관 튜브가 상단 CL의 "V" 홈에 있는지 확인합니다.amp. 상단 cl을 조입니다.amp.
5. 하단 CL로amp 열려 있으면 하단 CL까지 수직 슬라이드를 수동으로 조정하십시오.amp 상한에 도달합니다. 튜브가 하단 CL의 "V" 홈에 있는지 확인하십시오.amp. 하단 cl을 조입니다.amp.
6. 문을 닫고 '준비' 표시등이 켜져 있는지 확인합니다. 시작 버튼을 눌러 히터와 당기는 순서를 시작합니다(그림 1B).
7. 열과 중력이 모세관 튜브를 잡아당기고(그림 1C) 슬라이드가 아래로 이동한 후 히터가 자동으로 꺼지는지 확인합니다.
8. 문 여세요. 모세관 상단을 잡고 상단 cl을 풉니다.amp. 상부 모세혈관을 제거하고 따로 보관하십시오.
9. 하단 슬라이드에서 모세관 튜브를 잡고 하단 cl을 풉니다.amp. 하부 모세관 튜브를 제거하고 따로 보관하십시오.
10. 0.05μm 알루미나 연마 연삭판이 있는 미세 전극 베벨러를 사용하여 당겨진 모세관 튜브를 베벨링하여 주사 바늘을 만듭니다.
11. 표면을 덮을 만큼 분쇄판에 물을 충분히 피펫팅합니다(그림 1D).
12. 60rpm으로 회전하기 시작하도록 베벨러를 켭니다. 당겨진 모세관을 피펫 cl에 놓습니다.amp "V" 홈에 있습니다. 클램프를 조이고 피펫 클램프의 각도를 30°로 조정합니다.
13. 모세관의 뾰족한 가장자리 끝을 연삭판의 회전 중심에서 약 2/3 거리에서 조정합니다.
14. cl을 내립니다.amp매니퓰레이터 상단의 거친 제어 손잡이를 조정하여 모세관을 만듭니다. 모세관 끝이 물 표면 아래로 확장되어 연삭 플레이트의 연마 표면에 닿을 때까지 모세관 튜브를 계속 내립니다.
15. 베벨러에 부착된 현미경을 사용하여 베벨링 진행 상황을 모니터링합니다. 5분 후 미세 컨트롤을 조정하여 연삭판에서 유리 바늘을 들어 올립니다.
16. 유리 바늘을 제거하고 10배 배율로 놓고 모세관 끝을 확인합니다(그림 1E, F).
17. 막힘이 없는지 확인하기 위해 유리 바늘을 주사기의 피펫 홀더에 삽입하고 99% 에탄올이 함유된 1mL 튜브에 공기를 밀어 넣습니다. 바늘 끝에 기포가 생기면 바늘이 막히지 않고 미세 주입에 사용할 수 있습니다. 이 과정은 또한 유리 바늘의 무균 상태를 보장합니다.
18. 하나의 모세관 튜브는 최대 5μL의 유체를 수용할 수 있습니다. 모세관 튜브를 10개 섹션으로 표시하여 니들의 거리를 계산하여 0.5μL 부피를 표시합니다. 향후 준비를 위해 0.5μL를 유지하는 거리로 저울을 표시합니다. 5μL 바늘의 경우 0.7mm 떨어진 거리는 0.5μL와 같습니다(그림 1G).

2. 마우스 유리체강내 주사

1. 이 섹션의 모든 절차는 생물 안전성 레벨 2 조건에서 수행하십시오.
2. 수술대에 의료용 언더패드를 놓아 시술 부위를 준비합니다.
3. 마이크로인젝터를 켜고 마이크로인젝터에 부착된 압축 공기 탱크의 가스 밸브를 엽니다. 가스 공급이 약 60psi가 될 때까지 탱크 조절기를 조정하십시오.
4. 마이크로인젝터에서 화면에 Balance가 표시될 때까지 모드를 누릅니다. Balance를 누르고 컴퓨터 마우스를 수술대에 놓습니다. 스테인리스강 피펫 홀더를 주입기의 'Fill/Output'에 부착된 튜브에 연결합니다. 이 튜브는 항상 인젝터에 연결됩니다.
5. 바늘 주위의 피펫 홀더 커넥터를 단단히 조여 모세관 바늘을 피펫 홀더의 다른 쪽 끝에 삽입합니다.
6. 안과 현미경을 켜고 50%의 강도로 조명을 켭니다. 수술대의 시술 부위에서 현미경을 조정하고 현미경을 원하는 초점으로 조정합니다.
7. 절차를 시작하기 전에 페달 철수 반사를 테스트하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 마취에 대한 IACUC 승인 프로토콜을 따르십시오.
8. 마취된 마우스를 코가 오른쪽을 향하고 왼쪽으로 기울어지도록 하여 의료용 언더패드에 놓습니다.
9. 안과 현미경을 통해 마우스의 오른쪽 눈을 보고 눈 양쪽에 있는 역작용 집게의 집게를 열어 주사 부위를 노출시켜 뚜껑을 엽니다(그림 2C).
10. 마이크로인젝터에 연결된 마우스 패드를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 모세관 바늘에 Bacillus cereus(ATCC 14579) 박테리아 용액(200CFU/μL 희석)을 채웁니다(그림 2D).
11. 왼손으로 동물의 머리를 고정하고 바늘 끝을 눈의 가장자리에 놓습니다. 바늘을 비스듬한 위치에 놓고 45° 각도로 마우스 눈을 뚫되 주입할 때 바늘의 날카로운 끝(~0.5mm)만 삽입하도록 합니다.
12. 바늘 끝이 삽입되면 마우스 헤드에서 마우스 패드로 왼손을 이동하고 마우스 패드를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Brain Heart Infusion(BHI) 육수에 준비된 B. cereus 희석액 0.5μL를 주입합니다. 누출을 방지하려면 제거하기 전에 바늘 끝을 마우스 눈 안에 2-3초 동안 두십시오(그림 2E).
13. 집게를 풀고 마우스를 보온 패드 위에 있는 케이지에 넣습니다. 마취에서 회복될 때까지 이 마우스를 모니터링합니다(그림 2F).
14. 쥐가 마취에서 회복되면 케이지를 적절한 랙에 다시 놓습니다. 쥐가 망막 전기검사에 의한 망막 기능 분석을 받을 경우, 적절한 암흑 적응을 위해 케이지를 어두운 방으로 되돌려 보내야 합니다.

결과

그림 1: 경사진 유리 바늘 만들기. 유리 바늘은 바늘/피펫 풀러와 마이크로 피펫 베벨러를 사용하여 일회용 미세 모세관 피펫으로 만들었습니다. (A) 니들/피펫 풀러에 있는 클램핑된 유리 모세관 튜브. (B,C) 원하는 전압을 사용하여 유리 바늘을 만듭니다. (D) 유리 마이크로피펫을 베벨링하는 것. (E,F) 베벨 처리 전과 후의 유리 마이크로피펫. (E) 유리 바늘의 스케일링. 두 개의 블랙 포인트 사이의 공간은 0.5μL를 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포 마이크로인젝터	마이크로 데이터 기기, Inc.	오후2000	해당 없음
미세 모세관 피펫 5 마이크로 리터	킴블	71900-5	해당 없음
마이크로 피펫 베벨러	셔터 인스트루먼트 컴퍼니	BV-10	해당 없음
현미경 OPMI Lumera	자이스		해당 없음
리버스 액션 겸자	카테나	K5-8228	해당 없음