Bacterial Infection Quantitation Assay: A Method to Quantify intraocular Bacterial load in Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis(세균성 안구내염의 마우스 모델에서 안구 내 세균 부하를 정량화하는 방법)

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수확 튜브 준비

1. 1mm 멸균 유리 구슬을 1.5mL 나사 캡 튜브에 넣습니다.
2. 이 튜브를 건조한 환경에서 오토클레이브로 멸균하십시오. 사용하기 전에 튜브를 실온으로 식히십시오.
3. 1x 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL를 멸균 15mL 원심분리 튜브에 추가합니다.
4. 프로테아제 억제제 칵테일 정제 1정을 튜브에 넣으십시오. 소용돌이에 의하여 섞으십시오.
5. 프로테아제 억제제를 함유한 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 400μL를 각 오토클레이브 채취 튜브에 피펫으로 주입합니다. 튜브에 라벨을 붙이고 얼음 위에 올려 놓습니다. (그림 1A).

2. 눈 적출

1. 이 섹션의 모든 절차는 생물 안전성 레벨 2 조건에서 수행하십시오.
2. CO₂ 흡입으로 마우스를 안락사시킵니다. 2차 방법을 사용하여 안락사를 확인합니다.
3. 안락사된 쥐 머리를 단단히 잡고 감염된 눈의 양쪽에 있는 가는 집게를 엽니다. 머리를 향해 아래로 눌러 눈을 받칩니다. 집게가 눈의 구체 뒤에 있으면 집게를 함께 쥐십시오. 머리에서 집게를 당겨 안구를 분리합니다(그림 1B).
4. 즉시 안구를 라벨이 붙은 채취 튜브에 넣습니다. 튜브를 얼음 위에 60분 이상 놓지 마십시오(그림 1C).

3. 안구 내 세균 수

1. 이 섹션의 모든 절차는 생물 안전성 레벨 2 조건에서 수행하십시오.
2. 모든 채취 튜브가 조직 균질기에 있는 동안 단단히 닫혀 있고 균형이 잡혀 있는지 확인합니다(그림 2A). s를 균질화하기 위해 1분 동안 조직 균질화기를 켭니다.amp레. 30초 동안 기다렸다가 1분 더 켭니다. 얼음 위에 튜브를 놓습니다(그림 2B, C).
3. 20μL의 균질액을 180μL의 멸균 1x PBS로 순차적으로 전달하여 각 샘플을 10배 연속 희석합니다. ^10-7의 계수에 도달할 때까지 희석합니다(그림 2D).
4. 따뜻한 정사각형 BHI 플레이트의 각 행에 적절한 희석 계수로 레이블을 지정합니다. 각 희석액 10μL를 약 45° 기울어진 상단 BHI 플레이트로 연속으로 옮깁니다. 샘플이 플레이트 바닥에 거의 도달할 때까지 작동시킨 다음 플레이트를 평평하게 놓습니다(그림 2E).
5. 샘플이 BHI 한천에 흡수되면 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮깁니다. 군집은 인큐베이터에 넣은 후 8시간 후에 보이기 시작해야 합니다.
6. B. cereus 군체의 성장이 개별 군체를 식별하는 데 방해가 되기 전에 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다(그림 2F).
7. 표본의 농도를 정확하게 표현하려면 10-100개의 군체가 있는 행을 세십시오. 예를 들어, 45개의 콜로니가 있는 희석 분율이 ^10-4인 행의 농도는 4.5 x 10⁵ CFU/mL입니다.
8. 한쪽 눈당 박테리아의 총 수를 계산하려면 농도에 0.4를 곱하며, 이는 눈을 균질화하는 데 사용되는 1x PBS의 밀리리터 부피를 나타냅니다. 예를 들어, 4.5 x 10⁵ CFU/mL 농도는 한쪽 눈당 1.8 x 10⁵ CFU B. 대뇌로 변환됩니다.

그림 1: 감염된 쥐의 눈 적출. 감염 후 원하는 시점이 지난 후 멸균 핀셋을 사용하여 감염된 생쥐 안구를 채취합니다. (A) 멸균 유리 구슬을 함유한 PBS. (B) 감염된 눈의 적출. (C) 쥐의 눈이 들어 있는 채취 튜브.

그림 2: 안구 내 세균 수에 대한 적출된 안구 처리.(A) 감염된 안구가 조직 균질기에 단단히 고정된 채취 튜브. (B) 감염된 눈을 각각 1분씩 2회 균질화하였다. 박테리아 정량화를 위해 눈의 희석(D)을 균질화(C)하고 후속 도금(E)을 추적합니다. (E) 트랙 희석 후 대표 개체 Bacillus cereus colony.