IPE 및 RPE 세포 분리: 토끼 눈에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 기술

초록

출처: Bascuas, T., et al. 비바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 색소 상피 세포의 분리, 배양 및 유전 공학. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 토끼 모델에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 절차를 보여줍니다. 이 세포는 망막 퇴행성 질환에 대한 치료 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

뉴질랜드 흰 토끼는 복강내 0.9% NaCl에 희석된 펜토바르비탈(150mg/kg)을 과다 투여하여 안락사시켰고, 희생 직후 눈을 적출했습니다.

1. 준비 전

1. 완전한 배지(10% 소 태아 혈청(FBS), 80 U/mL 페니실린/80 μg/mL 스트렙토마이신 및 2.5 μg/mL 암포테리신 B가 보충된 DMEM/Ham의 F12)를 준비합니다. 배지, 1x PBS 및 0.25% 트립신(필요한 경우)을 37°C 수조에서 가열합니다.
2. 무균 작업 장소를 준비하기 위해 후드에 멸균 드레이프를 넣으십시오. 후드 내부에 필요한 모든 멸균 기구와 재료를 도입합니다.
   메모: 눈의 적출과 남아있는 근육 조직 및 피부의 청소만이 후드 외부에서 수행되는 절차이며 나머지 단계는 후드 내부에서 수행해야합니다.

2. 토끼 PE 세포의 분리

1. 구부러진 가위와 콜리브리 집게를 사용하여 동물을 안락사시킨 후 눈을 적출합니다. 가위와 집게(비멸균)를 사용하여 눈에 남아 있는 근육 조직과 피부를 청소합니다.
   메모: 눈의 적출 및 세척에 사용되는 가위와 집게의 크기는 종에 따라 다릅니다(예: 쥐와 쥐의 경우 기구가 돼지와 소에 사용되는 것보다 작을 것입니다)(그림 1 참조).
   1. 비멸균 PBS로 채워진 50mL 튜브에 눈을 모으고 튜브를 층류 후드로 옮깁니다. 요오드 기반 용액에 2분 동안 담가 눈을 소독한 다음 멸균 PBS로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.
2. 전구 개구
   1. 멸균 거즈 찜질에 한쪽 눈을 대고 시신경 가까이에 단단히 고정합니다. 메스 #11과 가장자리 아래 약 2mm 가위로 눈을 뜹니다. 앞쪽 부분(각막, 수정체, 홍채)을 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. RPE 세포가 분리될 때까지 전구를 유리체와 함께 둡니다.
3. IPE 세포의 분리
   1. 렌즈를 제거하고 미세한 집게로 IPE 세포가 들어있는 홍채를 섬세하게 당겨 빼냅니다. 홍채를 페트리 접시에 넣고 멸균 PBS로 씻고 더 많은 홍채가 준비될 때까지 PBS에 그대로 둡니다. 메스 #10으로 절단하여 홍채에서 섬모체를 제거합니다.
   2. 2개의 홍채를 준비한 후 37°C에서 10분 동안 0.25% 트립신 1mL로 배양합니다. 이 시간 동안 RPE 세포를 분리할 수 있습니다(2.4단계 참조). 트립신을 제거하고 홍채에 1mL의 완전한 배지를 첨가하고 납작한 화염 광택 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 긁어 세포를 분리합니다. 피펫팅을 통해 세포를 조심스럽게 재현탁시키고 세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액 10μL를 취하고 트리판 블루로 1:3으로 희석하여 Neubauer 챔버의 세포를 계수합니다.
   3. 즉시 transfection하지 않는 경우, 1mL의 완전한 배지(10% FBS)에 24-well 플레이트(100,000 cells/cm²)에 200,000 cells/well를 시딩합니다(seeding은 표 1 참조). 플레이트를 인큐베이터에 넣고 37°C, 5% CO2.
      에서 배양합니다. 메모: 파종을 위한 충분한 세포를 갖기 위해 여러 눈을 함께 모아야 할 수도 있습니다.
4. RPE 세포의 분리
   1. 얇은 집게로 뒤쪽 부분에서 유리체액과 망막을 제거합니다. 망막 색소 상피의 손상을 피하십시오.
   2. 멸균 거즈를 12웰 플레이트에 넣고 전구를 거즈 위에 놓습니다.
   3. PBS로 세척하십시오. 눈당 50μL의 0.25% 트립신을 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 트립신을 제거하고 구체당 150μL의 완전한 배지를 추가하고 곡선형 화염 광택 파스퇴르 피펫으로 RPE 세포를 섬세하게 긁어냅니다. 미세한 집게를 사용하여 조직을 고정시킵니다. 세포 현탁액을 수집하여 1.5mL 튜브에 넣습니다. 세포 현탁액 10μL를 취합니다. 트리판 블루(trypan blue)로 1:4를 희석하여 Neubauer 챔버의 세포를 계산합니다.
   4. 120 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.
   5. 즉시 transfection하지 않는 경우, 1mL의 완전한 배지(10% FBS)에 24-well 플레이트(100,000 cells/cm²)에 200,000 cells/well를 시딩합니다(seeding은 표 1 참조). 플레이트를 인큐베이터에 넣고 37°C, 5% CO2.
      에서 배양합니다. 메모: 파종을 위한 충분한 세포를 갖기 위해 여러 눈을 함께 모아야 할 수도 있습니다.

결과

종	트립신 치료	N° IPE 세포	N° RPE 세포	파종용 플레이트(100,000셀/cm2)
토끼	예	~350,000	~2,500,000	24웰 플레이트

표 1: 토끼의 눈에서 분리된 1차 PE 세포의 수.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12웰 플레이트	코 닝	353043
24웰 플레이트	코 닝	353047
베타딘	먼디제약
본 마이크로 집게 플랫
Colibri 겸자(멸균)
DMEM/햄의 F12	시그마-알드리치	D8062
드레이프(멸균)	Mölnlycke 건강 관리	800530
FBS(증권 시세	브룬슈비히	P40-37500
겸자(다른 크기)(멸균)
거즈 압축	프로메디컬 AG	25403
염화나트륨 (0.9%)	연구소 Dr. Bichsel AG	1000090
노이바우어 챔버	Marienfeld-superior	640010
파스퇴르 피펫 (파이어 폴리싱)	위테그	4100150
PBS 1배	시그마-알드리치	D8537
페니실린/스트렙토마이신	시그마-알드리치	P0781-100
펜토바르비탈(Thiopental inresa)	오스페달리아 AG	31408025
페트리 접시	써모피셔 사이언티픽	150288
스카펠 No. 10	스완-모튼	501
스카펠 No. 11	스완-모튼	503
날카롭고 날카로운 팁 곡선 엑스트라 파인 본 가위(멸균)
샤프-샤프 팁 스트레이트 엑스트라 파인 본 가위(멸균)
트립신 0.25%	써모피셔 사이언티픽	25050014
Vannas 스프링 가위 곡선 (멸균)

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