IPE 및 RPE 세포의 분리: 분리된 돼지 눈에서 색소 상피 세포를 얻는 기술

초록

출처: Bascuas T. et al., 비바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 색소 상피 세포의 분리, 배양 및 유전 공학. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 돼지의 눈에서 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하여 in vivo 및 ex vivo 연구를 위한 기본 배양을 얻는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 색소 세포는 안구 질환을 치료하기 위한 재생 접근법을 연구하기 위해 유전적으로 변형될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비 전

1. 완전한 배지(10% 소 태아 혈청(FBS), 80 U/mL 페니실린/80 μg/mL 스트렙토마이신 및 2.5 μg/mL 암포테리신 B가 보충된 DMEM/Ham의 F12)를 준비합니다. 배지, 1x PBS 및 0.25% 트립신(필요한 경우)을 37°C 수조에서 가열합니다.
2. 무균 작업 장소를 준비하기 위해 후드에 멸균 드레이프를 넣으십시오. 후드 내부에 필요한 모든 멸균 기구와 재료를 도입합니다.
   알림: 눈의 적출과 남아 있는 근육 조직 및 피부의 청소만 후드 외부에서 수행되는 절차이며 나머지 단계는 후드 내부에서 수행해야 합니다.
3. 돼지 눈은 희생 후 6시간 이내에 지역 도축장에서 얻어 얼음에 담아 실험실로 운반했습니다

2. 돼지 PE 세포의 분리

1. 구부러진 가위와 콜리브리 집게를 사용하여 동물을 안락사시킨 후 눈을 적출합니다. 가위와 집게(비멸균)를 사용하여 눈에 남아 있는 근육 조직과 피부를 청소합니다.
   메모: <....

결과

종	트립신 치료	N° IPE 세포	N° RPE 세포	파종용 플레이트(100,000셀/cm2)
돼지	아니요	~1,000,000	~3,000,000	24웰 플레이트

표 1: 서로 다른 nt 종의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12웰 플레이트	코 닝	353043
24웰 플레이트	코 닝	353047
베타딘	먼디제약
본 마이크로 집게 플랫
Colibri 겸자(멸균)
DMEM/햄의 F12	시그마-알드리치	D8062
FBS(증권 시세	브룬슈비히	P40-37500
겸자(다양한 크기)(멸균)
염화나트륨 (0.9%)	연구소 Dr. Bichsel AG	1000090
바늘 (18G)	테루모	TER-NN1838R
노이바우어 챔버	Marienfeld-superior	640010
파스퇴르 피펫 (파이어 폴리싱)	위테그	4100150
PBS 1배	시그마-알드리치	D8537
페니실린/스트렙토마이신	시그마-알드리치	P0781-100
페트리 접시	써모피셔 사이언티픽	150288
스카펠 No. 10	스완-모튼	501
스카펠 No. 11	스완-모튼	503
날카롭고 날카로운 팁 곡선 엑스트라 파인 본 가위(멸균)
샤프-샤프 팁 스트레이트 엑스트라 파인 본 가위(멸균)
Tali 이미지 기반 유세포 분석기	써모피셔 사이언티픽	T10796
트립신 0.25%	써모피셔 사이언티픽	25050014
트립신 5%/EDTA 2%	시그마-알드리치	T4174
Vannas 스프링 가위 곡선 (멸균)

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