IPE 및 RPE 세포의 분리: 분리된 돼지 눈에서 색소 상피 세포를 얻는 기술

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초록

이 비디오에서는 돼지의 눈에서 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하여 in vivo 및 ex vivo 연구를 위한 기본 배양을 얻는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 색소 세포는 안구 질환을 치료하기 위한 재생 접근법을 연구하기 위해 유전적으로 변형될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비 전

완전한 배지(10% 소 태아 혈청(FBS), 80 U/mL 페니실린/80 μg/mL 스트렙토마이신 및 2.5 μg/mL 암포테리신 B가 보충된 DMEM/Ham의 F12)를 준비합니다. 배지, 1x PBS 및 0.25% 트립신(필요한 경우)을 37°C 수조에서 가열합니다.
무균 작업 장소를 준비하기 위해 후드에 멸균 드레이프를 넣으십시오. 후드 내부에 필요한 모든 멸균 기구와 재료를 도입합니다.
알림: 눈의 적출과 남아 있는 근육 조직 및 피부의 청소만 후드 외부에서 수행되는 절차이며 나머지 단계는 후드 내부에서 수행해야 합니다.
돼지 눈은 희생 후 6시간 이내에 지역 도축장에서 얻어 얼음에 담아 실험실로 운반했습니다

2. 돼지 PE 세포의 분리

구부러진 가위와 콜리브리 집게를 사용하여 동물을 안락사시킨 후 눈을 적출합니다. 가위와 집게(비멸균)를 사용하여 눈에 남아 있는 근육 조직과 피부를 청소합니다.
메모: 눈의 적출 및 세척에 사용되는 가위와 집게의 크기는 종에 따라 다릅니다(예: 쥐와 쥐의 경우 기구가 돼지와 소에 사용되는 것보다 작을 것입니다)(그림 1 참조).
1. 비멸균 PBS로 채워진 50mL 튜브에 눈을 모으고 튜브를 층류 후드로 옮깁니다. 요오드 기반 용액에 2분 동안 담가 눈을 소독한 다음 멸균 PBS로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.
2. 멸균된 페트리 접시에 눈을 옮긴 후 콜리브리 또는 뾰족한 집게로 눈을 시신경 가까이에 단단히 잡습니다. 18g 바늘로 홍채 한계 근처(pars plana와 ora serrata 사이)에 구멍을 뚫습니다. 구멍에 작은 가위를 넣고 홍채 주위를 자릅니다. 앞쪽 부분(각막, 수정체, 홍채)을 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. RPE 세포가 분리될 때까지 전구를 유리체와 함께 둡니다.

3. IPE 셀의 격리

메스 #10으로 절단하여 홍채에서 섬모체를 제거합니다. 2개의 홍채를 준비한 후 1mL의 완전한 배지를 추가하고 납작한 화염 광택 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 긁어 세포를 분리합니다. 세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액 10μL를 취하고 트리판 블루로 1:4로 희석하여 Neubauer 챔버의 세포를 계수합니다.
즉시 transfection하지 않는 경우, 1mL의 완전한 배지(10% FBS)에 24-well 플레이트(100,000 cells/cm²)에 200,000 cells/well를 시딩합니다(seeding은 표 1 참조). 플레이트를 인큐베이터에 넣고 37 °C, 5% CO₂.
에서 배양합니다. 메모: 파종을 위한 충분한 세포를 갖기 위해 여러 눈을 함께 모아야 할 수도 있습니다.

4. RPE 셀의 격리

1.1.1단계를 수행합니다. 전구를 페트리 접시에 넣고 PBS로 씻으십시오. 전구에 1mL의 완전한 배지를 채웁니다.
구부러진 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 RPE 세포를 조심스럽게 제거합니다. 맥락막-브루흐의 막 복합체에서 미끄러지지 않도록 아래에서 위로 긁어내십시오. 1,000 μL 피펫을 사용하여 전구 내의 세포 현탁액을 수집하고 재현탁을 위해 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액 10μL를 취하고 트리판 블루로 1:8로 희석하여 Neubauer 챔버의 세포를 계수합니다.
3.2단계에서 설명한 대로 시드 세포.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호
12웰 플레이트	코 닝	353043
24웰 플레이트	코 닝	353047
베타딘	먼디제약
본 마이크로 집게 플랫
Colibri 겸자(멸균)
DMEM/햄의 F12	시그마-알드리치	D8062
FBS(증권 시세	브룬슈비히	P40-37500
겸자(다양한 크기)(멸균)
염화나트륨 (0.9%)	연구소 Dr. Bichsel AG	1000090
바늘 (18G)	테루모	TER-NN1838R
노이바우어 챔버	Marienfeld-superior	640010
파스퇴르 피펫 (파이어 폴리싱)	위테그	4100150
PBS 1배	시그마-알드리치	D8537
페니실린/스트렙토마이신	시그마-알드리치	P0781-100
페트리 접시	써모피셔 사이언티픽	150288
스카펠 No. 10	스완-모튼	501
스카펠 No. 11	스완-모튼	503
날카롭고 날카로운 팁 곡선 엑스트라 파인 본 가위(멸균)
샤프-샤프 팁 스트레이트 엑스트라 파인 본 가위(멸균)
Tali 이미지 기반 유세포 분석기	써모피셔 사이언티픽	T10796
트립신 0.25%	써모피셔 사이언티픽	25050014
트립신 5%/EDTA 2%	시그마-알드리치	T4174
Vannas 스프링 가위 곡선 (멸균)

표시기 호 의

종	트립신 치료	N° IPE 세포	N° RPE 세포	파종용 플레이트(100,000셀/cm²)
돼지	아니요	~1,000,000	~3,000,000	24웰 플레이트

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