세균성 각막염의 Porcine Ex vivo 각막 모델: 각막 상피 세포에서 세균 감염을 확립하는 기술

초록

출처: Okurowska, K., et al. 세균성 각막염에 대한 약물 치료를 연구하기 위한 돼지 생체 외 각막 모델 구축. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 돼지의 눈에서 절개한 각막 단추를 사용하여 세균성 각막염에 대한 체외 모델을 설정하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 접종된 박테리아는 각막 상피 절개 부위를 통과하여 기저 기질에 침입하고 각막 조직 내에서 생체 내 감염을 모방하는 감염을 일으킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 접종 준비

1. 폼 스토퍼가 있는 50mL 원뿔형 플라스크에 LB 육수 10mL를 붓습니다.
2. 새로운 한천 플레이트에서 P. aeruginosa 균주 PAO1 또는 균주 PA14의 군체를 옮기고 박테리아가 중간 로그 단계에 있을 때까지 37°C에서 3-4시간 동안 배양합니다.
3. 박테리아 배양액을 50mL 튜브에 옮기고 3,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 PBS에 다시 현탁시킵니다.
4. 1.3단계를 두 번 더 반복하여 세포를 씻습니다. PBS에 세포 펠릿을 재현탁하고 멸균 PBS를 블랭크로 사용하여 600nm에서 광학 밀도를 약 0.6으로 조정합니다.

2. 각막 단추 감염

1. 페트리 접시에서 매체를 제거하고 멸균 PBS 1mL로 각막을 두 번 헹굽니다.
2. 각막을 사이에 두고 집게를 부드럽게 짜냅니다. 10A 메스를 사용하여 각막 단추의 중앙 부분을 상피층을 통해 기저의 기질까지 총 4개(수직 2개, 수평 2개)를 자릅니다.
3. 멸균 유리 주형을 6웰 플레이트에 넓은 부분이 위로 향하게 놓고 각막을 상피 면이 아래를 향하도록 유리 주형 중앙에 놓습니다. 유리 주형의 바닥 부분 중앙에서 바로 절단하십시오.
4. 중요 단계: DMEM에 용해된 1%(w/v) 저융점 한천 1mL를 부어 유리 곰팡이를 각막으로 완전히 채웁니다.
5. 한천이 굳어지도록 한 다음 각막 상피가 위쪽을 향하도록 유리 주형을 뒤집습니다.
6. OD_600nm = 0.6(녹농균의 경우 15μL에서 약 1 x 10⁷ 집락 형성 단위(CFU)과 동일함)의 박테리아 배양 15μL를 절단 영역에 직접 피펫팅한 다음 각막 상피를 촉촉하게 유지하기 위해 상단에 85μL의 PBS를 추가합니다.남은 박테리아 배양액과 플레이트를 한천에 희석하여 접종물에 대한 집락 형성 단위를 계산합니다.
7. 유리 틀을 사용하여 각 웰의 바닥에 항생제를 사용하지 않은 DMEM 1mL를 추가합니다. 감염된 각막 버튼이 있는 6-well 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO₂로 최대 24시간 동안 배양합니다.
8. 모든 실험과 함께 감염되지 않은 대조군 각막을 설정합니다. 감염되지 않은 대조군을 설정하려면 2.6단계에서 15μL의 박테리아 배양을 멸균 PBS로 교체합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50 mL 팔콘 튜브	증권 시세	352070
암포테리신 B	시그마	A2942 (영어
Cellstar 12웰 플레이트	Greiner 바이오 원	665180
덱스트란	시그마	31425-100mg-F
디스텔	피셔 사이언티픽	12899357
DMEM + 글루타맥스	증권 시세	D0819
듀얼 오븐 인큐베이터	증권 시세	오베1020	살균 오븐
표피 성장 인자	증권 시세	E5036-200UG
F12 햄	시그마	N4888
태아 송아지 혈청	랩텍 인터내셔널	캘리포니아-115/500
집게	피셔 사이언티픽	15307805
헤라셀 VIOS 160i	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	15373212	조직 배양 인큐베이터
인슐린, 재조합 인간	증권 시세	91077C-1지
LB 한천	시그마	L2897
멀티트론	인포서	적용 할 수 없음	박테리아 인큐베이터
PBS (PBS)	증권 시세	P4417
페니실린-스트렙토마이신	증권 시세	P0781
페트리 접시	피셔 사이언티픽	12664785
페트리 접시 35x10mm CytoOne	스타랩	CC7672-3340
포비돈 요오드	Weldricks 약국	2122828
안전한 2020	피셔 사이언티픽	1284804	Class II 미생물학 안전 캐비닛
메스 칼날 번호 15	피셔 사이언티픽	O305
메스 스완 모튼	피셔 사이언티픽	11849002

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