생물막의 생체 외 돼지 폐 모델: 돼지 기관지 조직의 박테리아 생물막을 연구하기 위한 폐 모델을 개발하는 기술

초록

출처: Harrington, N.E. et al., 낭포성 섬유증 폐에서 녹농균 및 황색포도상구균 생물막의 생체 외 모델에서 항생제 효능 테스트. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 감염된 세기관지 조직에서 박테리아 생물막의 생체 외 돼지 폐 모델을 개발하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 생물막은 표면에 부착된 매트릭스에 내장된 박테리아 응집체입니다. 이 모델은 생물막 형성의 여러 단계에서 박테리아의 항생제 감수성을 연구하는 데 사용됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 생체 외 돼지 폐(EVPL) 조직의 해부 및 감염

1. EVPL 조직과 함께 사용하기 위한 SCFM을 만들고 표 1에 제공된 1L 변형 SCFM의 레시피를 따릅니다.
2. 해부하기 전에 P. aeruginosa/S. aureus에 대한 실험실에서 표준인 한천(예: 용원 육수 + 1.2% 한천)을 사용하여 감염에 필요한 박테리아 균주의 한천 플레이트를 준비합니다.
3. 감염되지 않은 대조군 조직 조각을 포함하여 실험에 얼마나 많은 돼지 세기관지 조직 조각이 필요한지 계산합니다. 이 숫자에 2를 곱하여 두 개의 복제 폐에서 실험을 반복하여 결과의 반복성을 확인합니다.
4. 필요한 총 조직 조각 수에 0.5를 곱하여 400 μL/조직 조각에 충분한 배지를 만들기 위해 아가로스 패드를 만드는 데 필요한 SCFM 아가로스(mL)의 부피와 준비 중 피펫팅 오류 또는 증발을 설명하기 위한 여분의 SCFM 한천의 부피를 계산합니다.
5. 0.8% 중량/부피 아가로스로 원하는 총 SCFM을 만드는 데 필요한 SCFM 15mL마다 0.12g의 아가로스를 추가합니다.
6. 아가로스가 완전히 용해될 때까지 SCFM 아가로스 용액을 가열합니다. 저전력의 가정용 전자레인지를 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 시간은 전자 레인지의 와트에 따라 다릅니다. 아가로스를 약 50°C로 식힙니다(만지면 따뜻하지만 잡기 편함). 더 이상 식히지 마십시오.
7. 피펫을 사용하여 필요한 조직 조각당 24웰 플레이트의 1웰에 400μL의 SCFM 아가로스를 추가합니다.
8. SCFM 아가로스 함유 24웰 플레이트를 자외선 아래에서 10분 동안 살균합니다.
9. 20mL의 멸균 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)과 50μg/mL 암피실린이 보충된 20mL의 멸균 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640을 사용하여 절개되는 모든 온전한 폐에 대해 3회 반복 세척을 준비합니다.
10. 절개되는 모든 손상되지 않은 폐에 대한 최종 세척으로 40mL SCFM의 부분 표본을 만듭니다. 모든 세척은 4°C에서 밤새 보관하거나 즉시 사용할 수 있습니다.
11. 도축 후 가능한 한 빨리 지정된 출처에서 폐를 구하여 가정용 냉각 상자에 넣어 실험실로 운송하여 차갑게 보관하십시오.
    메모: 도축 당일에 가까운 폐는 보관으로 인한 멍이 적지만 도축 후 최대 4일 동안 냉장 보관된 조직도 사용할 수 있습니다. 쿨박스는 정육점이나 도살장으로 가져와야 하므로 매번 사용 후에는 현지 실험실 지침에 따라 오염을 제거해야 하며 사용하지 않을 때는 미생물학 실험실 외부에 보관하여 오염 및 격리 위반의 위험을 줄여야 합니다.
12. 멸균된 표면과 화염 아래에서 작업하면서 오토클레이브 알루미늄 호일로 덮인 깨끗한 플라스틱 도마에 폐를 놓습니다. 세기관지가 손상되지 않았는지 확인하십시오. 도살장이나 운송 중에 손상이 있는 경우 폐는 사용하기에 적합하지 않습니다.
13. 팔레트 나이프를 화염 아래에서 가열하고 칼을 세기관지를 둘러싼 폐 부위에 아주 짧게 접촉하여 조직 표면을 살균합니다.
14. 멸균 장착된 면도날을 사용하여 세기관지를 둘러싼 표면 조직을 잘라냅니다. 손상을 방지하기 위해 세기관지와 평행하게 절개하십시오.
15. 세기관지가 노출되면 세기관지를 빼내기 위해 눈에 보이는 가장 높은 지점에서 세기관지를 통해 단면 절개를 만듭니다.
16. 멸균 집게를 사용하여 세기관지의 다른 쪽 끝을 가볍게 잡고 멸균 장착된 면도날을 사용하여 남아 있는 원치 않는 조직을 잘라냅니다. 폐에서 세기관지를 제거하기 위해 가지가 보이기 전에 세기관지를 가로질러 최종 단면 절개를 만듭니다.
17. 세기관지를 첫 번째 DMEM/RPMI 1640 세척에 넣습니다. 세기관지를 세척한 상태로 두고 1.12-1.15단계를 반복하여 계획된 실험을 위한 충분한 조직 절편을 생성하는 데 필요한 만큼 동일한 폐에서 추가 세기관지 절편을 채취합니다.
18. 동일한 폐의 추가 세기관지 절편을 세척제에 넣습니다(단계 1.17). 최소 2분 동안 세탁물에 그대로 두십시오.
19. 첫 번째 DMEM/RPMI 1640 세척에서 세기관지를 제거하고 샘플을 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
20. 멸균 집게를 사용하여 각 세기관지를 가볍게 잡고 조직이 손상되지 않도록 합니다. 남아있는 연조직을 최대한 제거하고 멸균 해부 가위를 사용하여 조직을 ~5mm 너비의 스트립으로 자릅니다.
21. 모든 세기관지 조직 스트립을 두 번째 DMEM/RPMI 1640 세척에 넣습니다. 최소 2분 동안 세탁물에 그대로 두십시오.
22. 멸균 집게를 사용하여 두 번째 세척에서 조직 스트립을 제거하고 조직이 손상되지 않도록 주의하십시오. 깨끗하고 멸균된 페트리 접시에 티슈를 넣습니다.
23. 세기관지에 붙어 있는 남아있는 연조직을 제거하고 멸균 해부 가위를 사용하여 스트립을 정사각형(~5mm x 5mm)으로 자릅니다.
24. 세 번째 DMEM/RPMI 1640 세척제를 페트리 접시에 추가합니다. 접시를 휘젓고 세척할 때 티슈 조각을 가볍게 섞습니다.
25. 티슈 조각을 제거하지 않고 페트리 접시에서 세 번째 세척을 붓습니다.
26. 티슈가 포함된 페트리 접시에 최종 SCFM 세척제를 추가하여 모든 티슈 조각이 덮이도록 합니다.
27. SCFM의 조직 조각을 자외선 아래에서 5분 동안 살균합니다.
28. 멸균 겸자를 사용하여 멸균된 각 세기관지 조직 조각을 SCFM 아가로스 패드가 포함된 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다.
29. 각 조직 조각을 원하는 박테리아 균주로 감염시키려면 멸균 0.5mL 인슐린 주사기에 부착된 29G 바늘 끝으로 한천 플레이트에서 자란 집락을 만집니다. 그런 다음 군체를 조직 조각에 대고 조직 표면을 부드럽게 찌릅니다.
    메모: 29G 바늘이 장착된 인슐린 주사기를 사용하면 바늘과 폐 조직에서 손가락을 안전한 거리에 유지하면서 바늘을 정확하고 편안하게 잡을 수 있습니다. 주사기에 부착되지 않은 29G의 바늘을 사용하여 이 단계를 수행할 수 있지만, 이 경우 더 많은 손재주가 필요하고 주사바늘 찔림 부상의 위험이 높아집니다. 인슐린 주사기는 쉽게 구할 수 있습니다.
30. 감염되지 않은 대조군의 경우, 멸균 0.5mL 인슐린 주사기에 부착된 29G 바늘 끝으로 각 조직 조각의 표면을 부드럽게 찌릅니다.
31. 피펫을 사용하여 각 웰에 500μL의 SCFM을 추가합니다.
32. 자외선 아래에서 각 24웰 플레이트에 대해 통기성 밀봉 멤브레인을 10분 동안 살균합니다(재료 표).
33. 24웰 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 통기성 멤브레인으로 교체합니다.
34. 흔들림 없이 원하는 배양(감염) 시간 동안 37°C에서 플레이트를 배양합니다. 감염되지 않은 대조군에서 접종된 병원체의 눈에 띄는 성장이 없는지 확인합니다(오염 대조군).
    메모: 원하는 경우, 암피실린을 SCFM 아가로스 패드에 첨가하고 단계 1.31에서 SCFM을 20μg/mL의 최종 농도로 덮을 수 있습니다. 이것은 녹농균(P. aeruginosa) 또는 황색포도상구균(S. aureus) 성장에 영향을 주지 않고 폐에 있는 대부분의 내인성 박테리아의 성장을 억제하지만, 암피실린의 존재가 다른 항생제에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 독자는 테스트하고자 하는 균주와 항생제에 따라 이러한 선택을 할 수 있습니다.

표 1

1. 생체 외 돼지 폐 모델과 함께 사용하기위한 합성 CF 가래 매체 (SCFM) 준비

일단 만들어지면 SCFM을 필터 멸균해야 하며 최대 한 달 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

하십시오. 분 분 . 호 분 호 호 호 일 . 년 호 분

a) 메인 레시피
단계 1	화학	분량	지시	1L SCFM의 최종 mM
	염화나트륨	3.03 지	SCFM 준비에만 사용되는 깨끗한 병에 소금과 물을 첨가	51.85
	케이클	1.114 지		14.94
	디H2O	640 밀리리터		해당 사항 없음
단계 2	화학	물에서 만든 스톡의 몰 농도, 필터 멸균 및 4°C에서 보관	지시	1L SCFM의 최종 mM
	나2HPO4	0.125 엠	1단계에서 준비한 소금과 물에 각 육수 10ml를 추가합니다	1.25
	나H2PO4	0.13 미터		1.30
	NH4Cl	0.228 엠		2.28
	KNO3	0.0348 엠		0.35
	K2이렇게4	0.0271 엠		0.27
	걸레	1 미터		10월 00
단계 3	화학		지시	1L SCFM의 최종 mM
	섹션 B에 따라 제조된 19개의 아미노산 용액)		1단계와 2단계에서 준비한 용액에 각 육수 10ml를 추가합니다.	섹션 b 참조)
단계 4	화학		지시	1L SCFM의 최종 mM
	HCl 또는 필요에 따라 NaOH		1-3 - 6.8 단계에서 준비된 용액의 pH를 조정하는 데 사용합니다. 추가된 산/염기의 기록적인 부피.	해당 사항 없음
단계 5	화학		지시	1L SCFM의 최종 mM
	dH2O		1-4단계에서 준비한 용액에 최종 부피 960ml까지 추가합니다.	해당 사항 없음
단계 6	화학	물에서 만든 스톡의 몰 농도, 필터 멸균 및 4°C에서 보관	지시	1L SCFM의 최종 mM
염화나트륨2	0.175 엠	1-5단계에서 준비한 용액에 각 육수 10ml를 추가합니다	1.75
마그네슘Cl2	0.0606 엠		0.61
단계 7	화학	물에서 만든 스톡의 몰 농도, 필터 멸균 및 4°C에서 보관	지시	1L SCFM의 최종 mM
	L-젖산	0.93 미터	5M NaOH로 pH를 7로 물에서 육수하십시오. 1-6단계에서 준비한 용액에 10ml를 추가합니다.	9.30
단계 8	화학	레시피에 추가하기 직전에 물에서 만든 작업 재고의 몰 농도	지시	1L SCFM의 최종 mM
	철(III)SO4.7H2O	0.00036 엠	0.036M 마스터 스톡을 만들고, 용액에 침전물이 없는 한 필터를 멸균하고 4°C에서 보관할 수 있습니다. 작업 스톡을 만들려면 110 μl의 마스터 스톡을 9.890 ml dH2O에 추가하고 1-7 단계에서 준비된 용액에 작업 스톡을 추가합니다.	0.0036

의 년 년 세 호 년 년 호 년 년 년 년 년 호 분 호 의 아오이트 년 년 년 년 년 년 년

b) 아미노산 원료의 준비; 필터는 사용 전에 살균하고 4°C에서 보관하십시오.
아미노산	mM 주식	지시	1L SCFM의 최종 mM
알라닌	178	물에 녹이십시오	1.780
아르기닌	30.6	물에 녹이십시오	0.306
아스파르테이트	82.7	0.5m NaOH에 용해	0.827
시스테인	16	물에 녹이십시오	0.160
글루타민산	154.9	1M HCl에 용해	1.549
글리신	120.3	물에 녹이십시오	1.203
히스티딘	51.9	물에 녹이십시오	0.519
이소류신	112.1	셰이커에서 50°C로 30분 동안 가열하여 물에 녹입니다	1.121
신	160.9	물에 녹이십시오	1.609
라이신	212.8	물에 녹이십시오	2.128
메티오닌	63.3	물에 녹이십시오	0.633
오르니틴-HCl	67.6	물에 녹이십시오	0.676
페닐알라닌	53	물에 녹이십시오	0.530
프롤린	166	물에 녹이십시오	1.660
세린	144.6	물에 녹이십시오	1.446
트레오닌	107.2	물에 녹이십시오	1.072
트립토판	1.3	0.2m NaOH에 용해	0.013
티로신	80.2	1M NaOH에 용해	0.802
발린	111.7	물에 녹이십시오	1.117

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인슐린 주사기 - 29G 바늘이 부착된 0.5mL.	폭스바겐	BDAM324892
24웰 배양 플레이트
70% 에탄올 또는 이와 유사한 해부 장비의 표면 살균 및 화염
P. aeruginosa/S. aureus의 줄무늬를 준비하기 위한 한천 플레이트(적절한 배지)
아가로스
알루미늄 호일 - 고압멸균으로 사전 멸균 - 폐를 해부하는 도마를 덮습니다.
Breathe-easy 또는 Breathe-easy 멀티웰 플레이트를 위한 밀봉 멤브레인	다각화된 생명공학	BEM-1 또는 BERM-2000
분젠 버너
도마 - 알코올로 쉽게 오염을 제거할 수 있도록 플라스틱 보드를 사용하는 것이 좋습니다.
폐를 실험실로 운반하는 Coolbox
다양한 크기의 해부 가위
Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)
대형 팔레트 나이프
장착된 면도날
페트리 접시
플라스틱 도마와 알루미늄 호일을 사용하여 멸균 및 세척 가능한 해부 표면 생성
로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체
사우스캐롤라이나			표 1에 열거된 성분
집게 선택(뭉툭한 끝 권장)
오염된 날카로운 물건과 돼지 폐 조직을 폐기하기에 적합한 용기, 해당 기관의 규정에 따 건강 및 안전 정책.

주