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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 조직 해부
- 비멸균 해부 작업 공간을 사용하여 돼지 조직을 준비합니다.
- 지역 도살장, 동물 연구 또는 공급업체에서 적출된 돼지 눈을 조달하십시오. 배송 중 PBS에 잠긴 얼음을 주시하고 수령 즉시 사용하십시오.
- 안와외 조직을 잘라내고 결막을 잘라내고 각막막막과 시신경만 남깁니다. 비멸균 상태에서 대형 수술용 가위와 집게를 사용하여 전체 해부 도구 팩에 넣어 해부를 수행합니다.
- 실험 설정에 필요한 모든 눈이 예비/전체 해부가 완료될 때까지 얼음 위의 새 PBS에 눈을 다시 놓습니다.
- 밀폐된 용기에 10% 베타딘 용액에 눈을 2분 동안 담그고 현저해부를 위해 BSC II 캐비닛(캐비닛 #1)으로 무균 상태로 옮깁니다. 설정 중 오염을 최소화하기 위해 멸균 상태에서 모든 후속 작업을 수행합니다.
- 전방 분절을 멸균적으로 절개합니다.
- 베타딘 용액에 2분 동안 담근 후, 안구 조직의 무균 상태를 유지하면서 안구 표면에서 과도한 베타딘 용액을 제거하기 위해 멸균 1x 항생제-항진균제-PBS(AA-PBS)를 3회 연속 세척합니다. 세 번 씻은 후 더 사용할 때까지 조직을 AA-PBS로 유지하십시오.
- 면도날/메스와 구부러진 가위를 사용하여 눈을 반구합니다. AA-PBS에 적신 거즈에 눈을 대고 멸균 면도날이나 메스로 눈의 적도 근처를 절개합니다(60/40 분할, 앞쪽 40개). 구부러진 수술 용 가위를 사용하여 눈을 반쪽으로 절제하여 앞쪽 눈 (각막 절반)을 분리합니다 .
메모: 전방 분절 주위의 절단은 장기 배양 후 유체 누출을 일으킬 수 있는 공막의 들쭉날쭉하고 거친 가장자리를 방지하기 위해 연속적이어야 합니다.
- 마이크로가위를 삽으로 사용하여 앞쪽 분절에서 유리체액을 퍼냅니다. 마이크로가위를 사용하여 앞쪽 부분에서 수정체를 제거합니다. 추가 절제 단계가 있을 때까지 AA-PBS의 전방 분절을 그대로 둡니다.
메모: 해부할 모든 눈은 이 단계에서 잡을 수 있으며 나머지 해부 과정을 통해 하나씩 촬영할 수 있습니다.
- 해부 현미경을 사용하여 섬유주 그물망(TM)이 보일 때까지 홍채에서 홍채뿌리까지 서서히 방사상으로 자릅니다. 고막은 각막 껍질 주위를 둘레로 향하는 섬유로 구성된 색소 조직입니다. 홍채뿌리 쪽으로 홍채를 조심스럽게 자르면 조직 아래의 고막상 깊이가 드러납니다.
- 조직을 처음 절개할 때와 동일한 깊이로 홍채 주위를 360° 절단하여 전체 TM 영역을 노출시킵니다. 필요에 따라 TM을 덮고 있는 남아 있는 홍채를 청소합니다.
- TM 뒤쪽의 섬모체 잔여물을 잘라내고, TM 부위 뒤쪽의 얇은 조직 띠(약 1mm)만 남깁니다.
- 접시 어셈블리 BSC II 캐비닛(캐비닛 #2)의 전안부 장기 배양(ASOC)에 추가 설정이 있을 때까지 절개된 전안부(AS)를 미디어에 배치합니다.
메모: 단일 사용자가 해부 및 장기 배양 접시 조립을 수행하는 경우 ASOC 설정 전에 이 시점에서 모든 눈을 가질 수 있습니다.