Anterior Eye Segment Culturing: 돼지 눈의 전방 분절 베어링 각막을 배양하는 방법

초록

출처: Boice, E. N., Snider, E. J. 개방구 부상 및 치료 성능 추적을 위한 전방 세그먼트 장기 배양 플랫폼. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오에서는 돼지 눈에서 각막이 있는 전방 안구를 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 배양 시스템은 눈 부상을 연구하기 위한 실험 모델로 사용됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 장기 배양 접시의 전안부 설정

1. AS가 거꾸로 된 상태로(컵 위로) 페트리 접시에 단일 전방 세그먼트(AS)를 놓습니다. 면봉을 사용하여 배지에 적시고 각막 중앙을 부드럽게 두드려 색소를 제거합니다. 집게를 사용하여 눈과 같은 면봉을 잡고 면봉으로 공막 주위를 닦아 여분의 색소를 제거합니다.
2. AS를 뒤집고 접시의 높은 부분 위에 접시의 바닥 부분 위에 놓고 각막을 접시의 높은 영역 위에 중앙에 놓습니다. 새로 배치된 AS 위에 클램핑 링을 놓습니다.
3. 해당 구멍에 4개의 나사를 끼워 링 아래에 AS와 함께 링을 제자리에 고정합니다. L-키로 나사를 부드럽게 손으로 조입니다.
   메모: 조임 단계는 실험 전반에 걸쳐 매일 발생하므로 여기서 초기 조임의 목표는 클램핑 링이 파손되지 않도록 하면서 매체가 누출되지 않도록 하는 것입니다.
4. 멸균 페트리 접시 세트를 사용하여 접시 위에 상단을 놓고 설정을 반전시킵니다. 접시 받침대를 부착합니다. O-링이 있는 유체 커넥터를 접시 바닥의 나사산 포트에 부착합니다.
5. 하나의 유체 커넥터에 18G 90° 구부러진 니들 허브, 튜브 길이, 18G 니들 허브, 나일론 시린지 필터, 3방향 밸브 및 미디어(Media)로 채워진 20mL 시린지를 부착합니다.
6. 두 번째 유체 커넥터에 18G 90° 구부러진 니들 허브, 튜브 길이, 18G 니들 허브, 3방향 밸브 및 멸균 10mL 주사기의 배럴 부분(ASOC에서 액체와 기포를 포집하는 저장소 역할을 함)을 부착합니다.
7. 3방향 밸브가 주사기에 적절하게 열린 상태에서 1.5단계에서 식별된 유체 커넥터 포트를 사용하여 시스템을 통해 매체를 부드럽게 밀어 AS를 팽창시키고 튜브의 매체를 채우고 결국 저장소를 채웁니다.
   메모: 매체가 ASOC 접시로 누출되면 AS가 클램핑 링으로 충분히 단단히 고정되지 않습니다.
8. 미디어를 접시에 부드럽게 밀어 넣고 접시를 뒤집어 거품을 저장소로 밀어 넣어 거품을 제거합니다.
9. 접시를 놓고 똑바로 서십시오. 페트리 접시의 바닥 부분을 스탠드 발 아래에 놓고 튜브가 꼬이지 않도록 주의하십시오.

2. 전안부 장기 배양 시작

1. ASOC는 이제 배양할 준비가 되었습니다. ASOC 접시를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 넣습니다. 압력 트랜스듀서 위의 인큐베이터에 있는 ASOC 접시의 높이가 알려져 있고 안압(IOP)을 정확하게 계산하기 위해 고려되었는지 확인합니다.
2. 튜브 라인이 도어의 개폐를 방해하지 않도록 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터 도어 바닥을 통해 밖으로 향하게 합니다. 20mL 주사기를 2.5μL/분의 속도로 설정된 주사기 펌프에 부착합니다.
3. 압력 변환기 기기에서 저장소가 있는 튜브 라인을 배치합니다. 기포가 튜브 라인으로 유입되는 것을 방지하기 위해 라인을 통해 PBS를 흐르게 하면서 측면 3방향 밸브를 압력 변환기 설정에 연결합니다.
   메모: 장기 배양 기간 동안 미생물 성장으로 인한 저장소 오염 가능성을 줄이기 위해 시스템을 설정한 후 저장소에서 PBS를 비웁니다.
4. 먼저 데이터 파일을 저장하기 위한 microSD 카드가 있는지 확인하여 IOP 데이터 수집을 시작합니다. 그런 다음 압력 변환기 설정을 켜서 데이터 수집을 시작합니다.

3. ASOC의 일일 유지 보수

1. ASOC가 24시간 동안 평형을 이룬 후 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 접시를 제거하고 생물 안전 캐비닛(BSC) II 캐비닛에 넣습니다.
   메모: 압력 데이터 수집에서 이러한 기간은 ASOC가 인큐베이터에서 제거되고(높이 변경) 캐비닛에서 조정됨에 따라 스파이크처럼 보입니다.
2. 페트리 플레이트의 각 접시 아래에 누출이 있는지 확인하십시오. 존재하는 경우 접시 아래에 단단히 조여진 유체 연결을 확인하고 필요한 경우 다시 조입니다. 멸균 L 키를 사용하여 cl의 나사를 조여 접시 상단의 누출을 확인하십시오.amping 링.
   메모: AS 공막 조직은 압축되어 두께가 24시간 감소하며 클램핑 링을 조여야 합니다.
3. 접시에서 배지를 잘 흡입하십시오.
   메모: 섬유주 그물망은 ASOC로 펌핑되는 매체에서 유체를 여과하는 것입니다. 따라서 미디어는 가장자리를 따라 ASOC 접시에 존재합니다.
4. 1.7단계와 1.8단계를 반복하여 갇힌 기포를 제거합니다.
5. 주사기 펌프에 주사기를 다시 채우고, 주사기 펌프가 작동하는지 확인하고, ASOC로의 관류를 위한 밸브의 정렬을 확인합니다. ASOC 접시를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터로 되돌립니다.
   메모: 이러한 단계는 매일 수행하는 것이 가장 좋습니다. 그러나 20mL의 시작 부피의 배지, ASOC 디쉬 웰 부피 및 2.5μL/분의 펌프 속도를 사용하면 시스템을 며칠 동안 방해받지 않고 실행할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10-32 폴리카보네이트 스트레이트 플러그, 수나사 파이프 커넥터	맥마스터-카	51525K431
10-32 소켓 캡 나사, 1/2"	맥마스터-카	92196A269
10mL 주사기	BD (영어)	302995
20mL 주사기	BD (영어)	제302830
안티 안티	지브코	제15240-096
볼 엔드 L 키	맥마스터-카	5020A25
BD Intramedic PE 160 튜빙	피셔 사이언티픽	14-170-12E
면봉	청교도	제25-8061WC
DMEM 미디어	증권 시세	2002년 30월 30
FBS(증권 시세	증권 시세	2020년 30월 30
가는 집게	세계적인 정밀 기기	15914
글루타맥스	지브코	제35050-061
고온 실리콘 O-링, 폭 2mm, ID 4mm	맥마스터-카	5233T47
못 (펑크 물체)	맥마스터-카	제97808A503
나일론 주사기 필터	어부	09-719씨
PBS (PBS)	지브코	제10010-023
폴리카보네이트, 3방향, 수형 루어 잠금 장치가 있는 스톱콕	어부	NC9593742
스테인레스 스틸 18G 90도 각도 분배 바늘	맥마스터-카	제75165A81
스테인레스 스틸 18G 스트레이트 1/2 "디스펜싱 바늘	맥마스터-카	제75165A675

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