출처: Ou, Q. et. al., 생리학적 조건에서 돼지 심장 절단 및 배양. J. Vis. 특급 (2020)
이 비디오는 돼지 심장의 실행 가능한 초박형 절편을 생성하는 진동 기반 절차를 보여줍니다. 준비된 조직 절편은 배양하여 약리학적 검사를 위한 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
돼지 심실 절편의 생성: 돼지 심장 조직의 초박형 절편을 준비하기 위한 비브라톰 기반 기술
3K 조회수
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2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 돼지 심장 조직 슬라이싱
- 비브라톰에 티슈 배스를 설정하고 티슈 배스 냉각 재킷에 얼음을 넣은 다음 티슈 수조에 Tyrode의 용액을 추가합니다. 티슈 수조 냉각 재킷에서 녹은 얼음의 처리를 수집하기 위해 1L 플라스틱 병을 설정합니다. 슬라이싱 Tyrode 용액 1L의 경우 3g/L 2,3-부탄디온 모노심(BDM), 140mM NaCl(8.18g), 6mM KCl(0.447g), 10mM D-글루코스(1.86g), 10mM HEPES(2.38g), 1mM MgCl2(1M 용액 1mL), 1.8mM CaCl2(1M 용액 1.8mL)를 혼합합니다. 최대 1L의 ddH2O. NaOH를 사용하여 pH를 7.40으로 조정합니다. 그런 다음 1,000mL, 0.22μm, 진공 필터/보관 시스템을 사용하여 용액을 여과하고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
- 생물 안전 캐비닛 아래에서 돼지 심장을 1L의 신선한 차가운 심정지 용액이 들어 있는 트레이로 옮깁니다. 심마비 용액 1L에 대해 110mM NaCl(6.43g), 1.2mM CaCl2(1M 용액 1.2mL), 16mM KCl(1.19g), 16mM MgCl2(3.25g), 10mM NaHCO3(0.84g), 1U/mL 헤파린, 최대 1L의 ddH2O를 혼합합니다. NaOH를 사용하여 pH를 7.40으로 조정합니다. 그런 다음 1,000mL, 0.22μm, 진공 필터/보관 시스템을 사용하여 용액을 여과하고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
메모: 1,000 U/L 헤파린을 자른 날 심정지 용액에 넣으십시오. - 심장을 절개하여 개폐식 멸균 메스를 사용하여 좌심실을 분리합니다. 그런 다음 면도날 사각형을 사용하여 좌심실을 각각 1-2cm3 블록으로 자릅니다. 한 조각은 슬라이스에 사용하고 나머지 조각은 50mL 튜브에 넣어 얼음 위에 올려 차가운 Tyrode 용액에 보관하여 필요한 경우 나중에 절단할 수 있습니다.
메모: 특히 이것이 두 번째 블록인 경우 손으로 자르기 전에 조직을 마사지하십시오. 마사지는 올바른 근섬유 구조를 회복하고 심장 차단 부위의 뻣뻣함을 방지하는 데 도움이 됩니다. - 금속 샘플 홀더에 조직 접착제(Table of Materials) 1-2방울을 추가하고 표면적이 약 1cm2인 4% 한천 블록 조각을 붙입니다.
- 한천에 조직 접착제 1-2방울을 추가합니다.
- 심장 심외막 쪽이 조직 접착제를 아래로 향하게 하여 심장 블록을 한천에 붙이고 가능한 한 평평한지 확인합니다. 그런 다음 심장 블록이 있는 티슈 홀더를 비브라톰의 슬라이싱 수조의 위치로 옮깁니다.
- 산소 튜브를 슬라이싱 수조에 부착하고 조각을 수집하기 위해 Tyrode의 용액(산소가 공급된 Tyrode의 수조)으로 채워진 금속 트레이를 부착합니다. 그런 다음 금속 트레이에 40μm 셀 스트레이너를 추가하여 절단 후 슬라이스를 수집합니다.
- 슬라이싱 위치 조정
- vibratome 작동 소프트웨어와 대시보드를 사용하여 블레이드/샘플의 높이를 조정합니다. 높이 버튼을 선택하고 화면의 지시에 따라 높이를 조정합니다. 이상적으로는 칼날을 조직 상단에 가깝게 두지만 유두 근육 아래에 놓고 자르기 전에 조직과 칼날을 덮고 있는 액체가 있는지 확인하십시오.
- 진행 버튼을 선택하여 조직 절단을 시작할 위치를 조정합니다. 슬라이스 버튼을 누르고 손잡이를 사용하여 속도를 높여 칼날을 티슈 가장자리 쪽으로 움직입니다. 그런 다음 slice를 다시 눌러 중지하고 advance 버튼을 눌러 프로세스를 비활성화합니다.
- 절단 매개변수를 조정합니다: 사전 속도 = 0.03mm/s, 진동 주파수 = 80Hz, 수평 진동 진폭 = 2mm. 그런 다음 슬라이스 버튼을 선택하여 슬라이싱을 시작합니다.
- 비브라톰이 조직의 끝에 도달할 때까지 절단하되 표본 홀더의 뒤쪽 끝에 닿기 전에 절단하도록 합니다. 이 시점에서 slice를 다시 눌러 중지합니다. Return 버튼을 눌러 시작 위치로 돌아갑니다.
- 자동 반복(두 번 클릭)을 선택하면 진동하는 마이크로톰이 슬라이싱 과정을 최대 99회까지 자동 반복할 수 있습니다.
- 슬라이스 수집
- 조각이 전체 길이가 되고 좋아 보일 때까지 기다린 다음(유두 근육 층을 통과한 후) 조각을 수집하기 시작합니다.
- 차가운 Tyrode의 용액을 채운 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 조각을 모아 욕조에서 티슈를 부드럽게 잡습니다. 필요한 경우 조직이 아직 부착되어 있는 경우 집게와 스프링 가위를 사용하여 심장 블록에서 슬라이스를 분리합니다.
- 산소가 공급된 티로드의 수조에 있는 하나의 세포 여과기로 슬라이스를 옮기고(1.7단계 참조) 플라스틱 파스퇴르 피펫의 액체를 사용하여 조직을 세포 여과기 중 하나에 평평하게 놓은 다음 상단에 금속 와셔를 추가하여 조직을 고정합니다.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로스 | 바이오라인 미국 | 바이오-41025 | |
| 2,3-부탄디온 모노심(BDM) | 어부 | AC150375000 | |
| 염화칼슘 (CaCl2 ) | 어부 | C79-500 | |
| 진동 마이크로톰을 위한 세라믹 블레이드 | Campden 악기 | 7550-1-C | |
| D-포도당 | 어부 | 라16-1 | |
| 일회용 메스 #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, 멸균, 코닝 | 폭스바겐 | 21008-952 | |
| 헤파린 나트륨 염 | 시그마-알드리치 | H3149-50구 | |
| 헤페스 | 어부 | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE 조직 접착제 | 아마존 | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| 아이리스 스프링 가위 | 어부 | NC9019530 | |
| 아이리스 스트레이트 가위 | 어부 | 731210 | |
| 염화마그네슘 (MgCl2) | 어부 | M33-500 | |
| 산소 조절기 | 프렉스에어 | ||
| 산소 탱크 | 프렉스에어 | ||
| 플라스틱 파스퇴르 피펫 | 어부 | 13-711-48 | |
| 염화칼륨(KCl) | 어부 | AC193780010 | |
| 면도기 직사각형 블레이드 | 어부 | 12-640 | |
| 개폐식 메스 | 어부 | 제22-079-716 | |
| 중탄산나트륨 (NaHCO3 ) | 어부 | AC217125000 | |
| 염화나트륨(NaCl) | 어부 | AC327300010 | |
| 진동 마이크로톰 | Campden 악기 | 7000 SMZ-2 |
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